VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA對(duì)血液EBV IgA檢測(cè)效果的研究

陳明星，廖秀梅，劉萬(wàn)里

(1.廣東省龍川縣人民醫(yī)院 517300；2.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東廣州 510060)

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·論 著·

VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA對(duì)血液EBV IgA檢測(cè)效果的研究

陳明星1，廖秀梅1，劉萬(wàn)里2△

(1.廣東省龍川縣人民醫(yī)院 517300；2.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東廣州 510060)

目的 探討中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研制的病毒殼抗原(VCA)+早期抗原(EA) 多肽片段聯(lián)合包被聚苯乙烯微孔板酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法對(duì)血液中Epstein-Barr病毒(EBV) 免疫球蛋白A(IgA)的檢測(cè)效果，并將其與進(jìn)口篩選試劑盒進(jìn)行比較，最終對(duì)VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA試劑盒性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 收集鼻咽癌患者血清86例，健康人群血清100例，用ELISA檢測(cè)血清中IgA的OD值，觀察該方法的最低檢測(cè)限、線性范圍、精密度、回收率，同時(shí)采用進(jìn)口的Epstein-Barr病毒持續(xù)表達(dá)核抗原(EBNA1)+VCA-p18抗原包被ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察其臨床性能。結(jié)果 VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法最低檢測(cè)限為(0.003 4±0.002 6)，血清稀釋100倍數(shù)(及以上)，其水平與吸光度呈線性關(guān)系，陰性標(biāo)本、弱陽(yáng)性標(biāo)本、陽(yáng)性標(biāo)本IgA水平的日內(nèi)變異系數(shù)為3.97%、9.76%、9.23%，日間變異變異系數(shù)分別為7.56%、10.20%、7.67%。VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被試劑盒與EBNA1+VCA-p18抗原包被試劑盒比較，相關(guān)系數(shù)為0.926 6；檢測(cè)鼻咽癌敏感性為88.90%，特異性為77.80%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為80.00%，陰性預(yù)測(cè)值為87.50%。結(jié)論 VCA+EA多肽片段聯(lián)合檢測(cè)鼻咽癌有較高敏感性，重復(fù)性較好，陰性結(jié)果預(yù)測(cè)較可靠，可作為臨床篩查鼻咽癌的新方法。

鼻咽癌； Epstein-Barr病毒； 免疫球蛋白A

鼻咽癌是我國(guó)南方常見(jiàn)惡性腫瘤，廣東為高發(fā)區(qū)。其發(fā)生、發(fā)展與Epstein-Barr病毒(EBV)感染密切相關(guān)[1]。檢測(cè)血清中EBV的某些抗體水平已成為早期診斷鼻咽癌的1種有效手段。目前用于檢測(cè)鼻咽癌的血清抗體有多種，包括有EBV持續(xù)表達(dá)核抗原(EBNA1)產(chǎn)生的EBNA1-免疫球蛋白A(IgA)、EBNAl-免疫球蛋白G(IgG)，BamH1Z轉(zhuǎn)錄因子Zta產(chǎn)生的Zta-IgA、Zta-IgG和病毒殼抗原(VCA)產(chǎn)生的VCA-IgA、VCA-p18-IgA、 VCA-p18-IgG、gp125-IgA，早期抗原(EA)-IgA[2]，EBV特異性DNA酶(EBV-DNase)抗體，ZEBRA-IgG及近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的胸苷激酶(TK)抗體等。而檢測(cè)血清中抗體方法則包括Western Blot、高效液相色譜(HPLC)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，免疫酶染色法(IEA)，光化學(xué)發(fā)光法等。臨床常用ELISA檢測(cè)患者血清抗體水平。早期診斷鼻咽癌，除檢測(cè)血清抗體水平外，還可檢測(cè)血清潛伏蛋白LMP-1、小分子RNA[3]。不過(guò)，早期診斷方法雖多，但大多準(zhǔn)確度、特異性不高，其他則方法復(fù)雜、操作繁瑣、進(jìn)口試劑昂貴，不利于臨床實(shí)際運(yùn)用，尤其是衛(wèi)生設(shè)施條件較差的社區(qū)衛(wèi)生醫(yī)療機(jī)構(gòu)。因此，需要尋求1種成熟簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的方法。現(xiàn)就中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究的VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康人群血液標(biāo)本100例，收集廣東省龍川縣人民醫(yī)院血庫(kù)獻(xiàn)血者；陽(yáng)性血液標(biāo)本86例，收集自中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)由鼻咽鏡和(或)病理診斷為鼻咽癌患者。收集后分裝，-20 ℃下保存，避免反復(fù)凍融。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 采用Thermo Labsystems MK3酶標(biāo)儀和鄭州博賽生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)的Biocell-AW1洗板機(jī)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的XMT-152A 型37 ℃溫育箱。

1.2.2 試劑 由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)、血清和兔抗人抗體稀釋液(1%的PBS-Tween 20，0.1%的牛血清清蛋白，聚乙二醇辛基苯基醚)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗人IgA及VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被酶標(biāo)板。北京現(xiàn)代高達(dá)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TMB(3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺)顯色液A、B和0.3 mol/L H2SO4終止液(批號(hào)為200902001)。EBNA1+VCA-p18進(jìn)口IgA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自愛(ài)爾蘭 Vrije Universiteit Medical Center。

1.3 方法 將1∶100稀釋血清100 μL加入VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA酶標(biāo)板反應(yīng)孔內(nèi)，37 ℃溫育1 h，洗滌后加酶標(biāo)兔抗人IgA 100 μL，37 ℃溫育1 h，洗滌后加顯色液TMB A、B液后暗室顯色10 min，加終止液，在450 nm主波長(zhǎng)和630 nm副波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

2 結(jié) 果

2.2 線性試驗(yàn)和線性范圍 取混合血清標(biāo)本，分別做5點(diǎn)倍比稀釋(未稀釋、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16)。測(cè)得平均OD值分別為1.176、0.723、0.587、0.316、0.254，樣品稀釋度與測(cè)定值呈線性關(guān)系，得其直線回歸方程Y=0.954 5X+0.241 8，r=0.970 9，見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)血清和稀釋液比依次為0∶1、1∶250、1∶200、1∶150、1∶100、10∶90、30∶70、60∶40、80∶10、1∶0等不同水平的系列標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，每點(diǎn)各測(cè)2次，算得平均OD值分別為：0.463、0.456、0.514、1.194、0.734、0.666 5、0.488 5、0.366、0.499 5、0.011，將吸光度與稀釋度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。數(shù)據(jù)采用最小二乘法原理，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，得到在血清稀釋100倍(及以上)時(shí)血清IgA水平與吸光度呈線性關(guān)系。

圖1 線性試驗(yàn)水平-吸光度曲線

圖2 線性范圍試驗(yàn)水平-吸光度曲線

2.3 精密度試驗(yàn) 選取陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性3例血清標(biāo)本分別在1 d內(nèi)重復(fù)測(cè)試20次，得到日內(nèi)變異系數(shù)分別為3.97%、9.76%、9.23%，見(jiàn)表1。將這3例標(biāo)本分裝在(-20)℃冰箱保存，每天1次，連續(xù)5 d檢測(cè)這3例標(biāo)本，得到日間變異系數(shù)為7.56%、10.20%、7.67%，見(jiàn)表2[5]。

表1 日內(nèi)變異系數(shù)測(cè)試結(jié)果

表2 日間變異變異系數(shù)測(cè)試結(jié)果

2.4 回收試驗(yàn) 取高OD值和低OD值標(biāo)本各一例制成混合血清標(biāo)本，測(cè)得混合血清IgA的OD值為0.392[5]，而 IgA標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD值為1.02，作4點(diǎn)回收：第1點(diǎn)，混合血清+等體積稀釋液；第2點(diǎn)，混合血清+等體積原倍標(biāo)準(zhǔn)液；第3點(diǎn)，混合血清+(1∶2)倍稀釋等體積標(biāo)準(zhǔn)液；第4點(diǎn)，混合血清+(1∶4)倍稀釋等體積標(biāo)準(zhǔn)液。使其理論OD值分別為0.196，0.706，0.451，0.323 5。測(cè)定值分別為0.198，0.71，0.46，0.305，得到IgA回收率分別為100.78%，103.52%，85.49%，平均為96.6%。

2.5 對(duì)比試驗(yàn) 隨機(jī)選取正常和異常血清標(biāo)本各72例(共144例)，分別采用EBNA1+EB-VCA-p18聯(lián)合包被ELISA微孔板和VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA微孔板，檢測(cè)標(biāo)本血清中IgA水平的OD值，并將2種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，得到線性方程Y=0.914 2X，和r=0.959 6。2種方法測(cè)定的OD值經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0計(jì)算整理、比較結(jié)果[6]，見(jiàn)表3。將數(shù)據(jù)分為NPC患者和健康人群2組制作箱圖，結(jié)果表明，2種方法中鼻咽癌患者和健康人群的中位數(shù)差距比較顯著，陰、陽(yáng)性判斷可靠性較好；2組中位數(shù)上下25%不相交，可認(rèn)為VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法可用于疾病診斷。

表3 2種方法OD值比較

2.6 2種方法臨床性能比較 隨機(jī)選取正常和異常血清標(biāo)本各72例(共144例)，分別采用EBNA1+EB-VCA-p18聯(lián)合包被ELISA微孔板和VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA微孔板檢測(cè)。結(jié)果采用SPSS13.0軟件分析。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，通過(guò)曲線下面積(AUC)計(jì)算Cut-off值及2種方法的敏感性、特異性。VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法Cut-off值為0.242，敏感性為88.90%，特異性為77.80%。EBNA1+EB-VCA-p18聯(lián)合包被ELISA方法Cut-off值為0.215，敏感性為88.90%，特異性為80.60%[7]。EBN1+EB-VCA-p18聯(lián)合包被ELISA方法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)為83.12%，陰性預(yù)測(cè)值(NPV)為88.60%。 VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法的PPV為80.00%，NPV為87.50%。見(jiàn)表4。

表4 2種方法臨床性能比較(%)

3 討 論

EBV是1種嗜B細(xì)胞的人類皰疹病毒，主要侵犯B細(xì)胞，對(duì)人體B淋巴細(xì)胞親和力高。人類受EBV感染十分普遍，但僅有極少數(shù)個(gè)體發(fā)生惡性腫瘤，且EBV感染個(gè)體不論有否發(fā)生惡性腫瘤均可產(chǎn)生一系列抗體[8]。EBV與鼻咽癌關(guān)系密切，目前常規(guī)采用的EBV血清學(xué)檢查項(xiàng)目VCA-IgA和EA-IgA仍是鼻咽癌患者臨床篩查、輔助診斷及療效判斷的觀察指標(biāo)。而血漿中的DNA測(cè)定在臨床分型和鼻咽癌療效檢測(cè)方面比VCA-IgA和EA-IgA更有價(jià)值，特異性和敏感性更高[9]。但是，單純定性地測(cè)定血漿中的DNA意義不大，半定量測(cè)定DNA需要昂貴的儀器和試劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高。所以，需要在免疫學(xué)上尋找EBV特異性抗原及其抗體的不同檢測(cè)方法，降低成本，提高臨床性能。

通過(guò)對(duì)VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法的研究試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該方法最低檢測(cè)限與檢測(cè)系統(tǒng)有關(guān)，如包括微孔板孔差、酶標(biāo)儀穩(wěn)定性、電壓低噪音等。血清IgA水平與吸光度線性相關(guān)高度相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0.970 9，血清測(cè)定線性范圍在稀釋100倍(及以上)時(shí)有較好線性，表明該方法臨床采用可行，所需標(biāo)本量不大。精密度試驗(yàn)顯示，VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法的日內(nèi)變異系數(shù)雖在可接受范圍內(nèi)，但日間變異系數(shù)存在大于10%的情況，表明其穩(wěn)定性還需進(jìn)一步改進(jìn)及論證。回收試驗(yàn)結(jié)果表明，VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法準(zhǔn)確度可靠，平均回收率達(dá)96.6%。

分別采用EBNA1+EB-VCA-p18聯(lián)合包被ELISA微孔板和VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA微孔板檢測(cè)140例標(biāo)本，結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.926 6，t檢驗(yàn)顯示2種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可替代性。箱圖表明，2種方法中鼻咽癌患者和健康人群的中位數(shù)差距比較顯著，陰、陽(yáng)性判斷可靠性較好；2組中位數(shù)上下25%不相交，可認(rèn)為VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法可用于疾病診斷。

從臨床效能ROC曲線分析，EBNA1+EB-VCA-p18聯(lián)合包被ELISA方法Cut-off值(0.215)小于VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法(0.242)，2種方法的敏感性均為88.90%，表明2種方法診斷能力相當(dāng)；特異性方面，VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法(77.80%)小于EBNA1+EB-VCA-p18聯(lián)合包被ELISA方法(80.60%)，提示前者鑒別未患NPC能力稍弱。VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法PPV、NPV都高于80%，表明其鑒別能力較好。VCA+EA 多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法的4個(gè)指標(biāo)均小于EBNA1+EB-VCA-p18聯(lián)合包被ELISA方法，表明前者與后者存在一定差距；且其低于Fachiroh等[10]報(bào)道的數(shù)據(jù)，表明其還有改進(jìn)的空間。從探索新方法檢測(cè)血清中IgA水平上看，VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法的敏感性和NPV已經(jīng)可以滿足臨床疾病篩查。

ELISA發(fā)展已久，已成為一項(xiàng)成熟檢測(cè)工藝，其檢測(cè)血液中的抗原(抗體)相對(duì)比較開(kāi)放，只要包被不同抗原(抗體)和提供酶標(biāo)二抗，就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗體(抗原)，并可嘗試用不同的抗原檢測(cè)病毒血清抗體[11]，以尋求臨床早期診斷和疾病療效監(jiān)測(cè)的最佳監(jiān)測(cè)條件。VCA+EA多肽片段聯(lián)合包被ELISA方法作為一種改進(jìn)方法，可稱為提高醫(yī)療技術(shù)水平的1種新途徑。

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Evaluation of double peptides of VCA and EA coated ELISA test in detection of serum EBV IgA

CHENMingxing1,LIAOXiumei1,LIUWanli2△

(1.People′sHospitalofLongchuanCounty,Longchuan,Guangdong517300,China;2.CancerCenterofSunYat-SenUnivercity,Guangzhou,Guangdong510060,China)

Objective To study the value of double peptides of VCA and EA coated ELISA test(EBNA1+ EB-VCA-p18) in serological diagnosis of IgA of Epstein-Barr Viruses(EBV)and to compare the effect with import screening kit.Methods By synthetic peptides EBNA1 and EB-VCA-P18 to establish ELISA assay,serum samples from 86 cases with nasopharyngeal carcinoma and 100 healthy people were collected.And the OD value of IgA was detected.The lowest detectable limit,linearity,precision and recovery were observed.The import ELISA kit of EBV VCA-p18/IgA was used as comparison.Results The lowest detectable limit of this mothed was (0.003 4±0.002 6) after the serum was diluted above 100 times.The level of IgA and absorbance had linear correlation.Daily variation coefficients of the level of IgA in negative samples,weakly positive samples and positive samples were 3.97%,9.76% and 9.23% respectively.Between-day variation coefficients were 7.56%,10.20% and 7.67% respectively.The double peptides of VCA+EA coated ELISA test was positively correlated with EBNA1+EB-VCA-p18 coated ELISA test(r=0.926).The sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value of the test were 88.90%,77.80%,80.00% and 87.50% respectively.Conclusion The double peptides of VCA+EA coated ELISA test has good sensitivity and repeatability,and negative predictive results are reliable,which could be used as a new way to screen nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr viruses; IgA

陳明星，男，主管技師，主要從事化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)和病原微生物方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.028

A

1673-4130(2016)21-3024-03

2016-02-03

2016-04-23)