熒光定量PCR快速篩查脊髓性肌肉萎縮癥smn1致病基因攜帶者*

鄧坤儀,彭建明,范漢恭,李麗蓮,向燕群

(南方醫科大學附屬中山博愛醫院檢驗科，廣東中山 528403)

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·論 著·

熒光定量PCR快速篩查脊髓性肌肉萎縮癥smn1致病基因攜帶者*

鄧坤儀,彭建明,范漢恭,李麗蓮,向燕群

(南方醫科大學附屬中山博愛醫院檢驗科，廣東中山 528403)

目的 采用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術檢測脊髓性肌肉萎縮癥(SMA)運動神經元生存基因1(smn1)基因拷貝數，快速篩查SMA致病基因攜帶者。 方法 采用熒光定量PCR技術檢測經多重連接探針擴增技術(MLPA)確認的21例SMA攜帶者、79例健康人群標本,及另200例本地人群標本。 結果 21例SMA攜帶者及79例健康人群標本檢測結果與MLPA符合率均達100.0%；200例本地人群標本中，4例smn1基因拷貝數為1(為攜帶者)，占2.0%；173例smn1基因拷貝數為2，占86.5%；23例smn1基因拷貝數為3，占11.5%。 結論 熒光定量PCR技術是1種快速、簡便和準確的SMA致病基因攜帶者檢測技術。

熒光定量PCR； 脊髓性肌肉萎縮癥； 運動神經元生存基因1

脊髓性肌肉萎縮癥(SMA)是常染色體隱性遺傳性神經肌肉病，居致死性常染色體隱性遺傳病第2位，僅次于囊性纖維變性[1]，人群中發病率為1/6 000～1/10 000。最近報道中國人群SMA致病基因的攜帶者頻率為1/42[2]。位于染色體5q11.2～q13.3 上的運動神經元生存基因(smn)是SMA的主要致病基因，其具有2個高度同源的拷貝smn1和smn2，兩者僅有5個堿基差別，分別位于第7、8外顯子和第6、7內含子中。既往研究已證實，90%以上的SMA為smn1基因缺失所致[3]，檢測smn1拷貝數可以確診SMA患者和攜帶者[4]。SMA基因目前多采用聚合酶鏈式反應限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析技術及多重連接探針擴增技術(MLPA)進行診斷[5-6]，兩者操作都比較繁瑣，需要特定儀器及有經驗的操作人員。本研究擬采用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)技術，定量檢測smn1基因拷貝數，可簡單快速進行SMA攜帶者檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從中山市博愛醫院檢驗科收集2015年1～6月乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周全血標本300例。男性167例，女性133例；年齡18～51歲，平均(31.6±10.8)歲；其中100例經MLPA確認smn1拷貝數，21例為SMA攜帶者，79例為健康人群；另200例標本為隨機收集，用于分析本地區表觀健康人群SMA致病基因攜帶者頻率調查。所有標本采用傳統酚-氯仿法抽提外周血基因組DNA。

1.2 方法 擴增smn1及清蛋白12號外顯子的引物由賽默飛世爾中國有限公司合成，擴增smn1引物序列如下：上游引物R1，5′-CCT TTT ATT TTC CTT ACA GGG TTT C-3′；下游引物R2，5′-GAT TGT TTT ACA TTA ACC TTT CAA CTT TT-3′。采用人血清清蛋白12號外顯子作為參比基因，擴增清蛋白引物序列如下：上游引物R3，5′-AGC TAT CCG TGG TCC TGA AC-3；下游引物R4，5′-TTC TCA GAA AGT GTG CAT ATA TCT G-3′。采用羅氏LightCycler480擴增儀進行檢測，總反應體積20 μL，10 μL LightCycler480 SYBR Green I Master，20 ng基因組DNA(8 μL)，分別在不同反應管中加入0.1 μmol/L 和0.5 μmol/L smn1和清蛋白引物。擴增條件為95 ℃預變性10 min，然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，共40個循環。每個標本平行測定3次。

1.3 統計學處理 采用2-△△Ct數學模型進行結果計算。在每次檢測待測標本時，同時檢測1～3例健康標本，分別計算待測標本及健康標本待測基因與參比基因Ct的差值(△Ct)，再將待測標本的△Ct減去健康標本的△Ct，得到△△Ct，計算2-△△Ct即可得到待測標本相對于健康標本目的基因的相對拷貝數,2-△△Ct結果為1.0即為健康人群，為0.5即為SMA致病基因攜帶者，為0即為SMA患者。

2 結 果

2.1 已知基因型標本熒光定量PCR 檢測結果 經MLPA檢測基因型已知的21例SMA攜帶者標本及79例健康對照標本，通過熒光定量PCR分析檢測結果與MLPA法符合率達100.0%，見表1。

表1 已知基因型標本熒光定量PCR檢測smn1結果

2.2 本地人群標本smn1基因拷貝數結果 200例本地人群標本中，smn1基因拷貝數為1的有4例，其2-△△Ct值為0.39～0.56，攜帶者頻率為2.0%；其余標本2-△△Ct值為0.87～1.69，絕大部分smn1基因拷貝數為2，見表2。

表2 本地人群標本熒光定量PCR檢測smn1結果

3 討 論

根據SMA發病年齡和病情嚴重程度不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型:其中Ⅰ型SMA，患兒于出生后6個月內發病，不能獨坐，多于2歲內死于呼吸功能不全；Ⅱ型SMA，出生后6～18個月發病，患兒可獨坐，但不能獨立行走，大多能存活2年以上；Ⅲ型SMA，出生18個月后發病，呈慢性進展，可以保持獨立行走和站立的能力，一般在成年后死亡。近年來有人提出存在Ⅳ型(或稱成人型)SMA，此型SMA非常少見，病情輕微。4種SMA都可能由smn1發生缺失、重排或小的基因內突變所致。大部分健康人smn1拷貝為2，約5%的健康個體有3個smn1拷貝，攜帶者smn1拷貝數為1[7]。smn2是與smn1高度同源的基因，是SMA患者臨床表型的調節基因，其拷貝數越多，產生的全長轉錄產物也越多，可部分補償SMN蛋白不足，減輕SMA患者臨床表現，也可預測SMA患兒病程進展[8]。提高smn2產生全長SMN2蛋白量是日后對SMA進行基因治療的研究方向。

熒光定量PCR對于smn1基因的檢測，主要是比較標本中smn1基因與健康對照的相對量以推定其拷貝數，所以采用無需標準品的相對定量方法。由于缺失1個smn1基因標本與未缺失標本之間基因的拷貝數差異僅為1倍，體現在Ct值上的變化非常小，需要恰當的數據處理模式將這種微小的差異檢測出來。采用2-△△Ct數據處理模式，每次檢測標本時同時檢測1～3例健康對照標本，分別計算待測標本及健康對照標本的△Ct(目的基因減去參比基因Ct值)，將待測標本△Ct減去健康對照標本△Ct，得到△△Ct，然后計算2-△△Ct，得到目的基因相對參比基因的拷貝數。這種目的基因相對定量模式，無需制備標準曲線，可靈敏地檢測出基因拷貝數的差異。

筆者篩查了200例本地人群標本，發現4例smn1基因拷貝數為1的SMA攜帶者，與之前關于中國人群SMA致病基因攜帶者頻率的報道相近[1,9]，smn1基因拷貝數為2的標本有173例，占86.5%，smn1基因拷貝數為3的有23例，占11.5%。

由于患者來源限制，本研究沒有檢測SMA患者標本，也沒有檢測SMA患兒父母的標本。本研究采用與MLPA進行比較的方法來驗證當前方法。對經MLPA法檢測基因型已知的21例SMA攜帶者標本及79例健康人群標本，熒光定量PCR分析所檢測的結果與MLPA的相符率達100.0%。MLPA是1種高通量、針對待測核酸中靶序列進行定性和半定量分析的新技術，該技術可對待測基因所有外顯子的缺失及重復狀況進行檢測，結果準確，目前國內外眾多學者均將其用于SMA的基因檢測[6,10]。不過，其方法存在操作繁瑣，對操作人員要求較高等缺陷。熒光定量PCR方法操作簡單，可以大批量進行檢測，結果準確。

SMA目前尚無有效的治療手段，病情嚴重，將對患者家庭和社會帶來沉重負擔。本院負責全市大多數人口的婚前醫學檢查和孕前優生健康檢查，探索1個適合本地區的SMA篩查方法，并通過檢測SMA攜帶者，對高危夫婦進行婚姻及生育指導，對有效降低SMA發病率、提高人口素質有重要意義。

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Application of real-time quantitative polymerase chain reaction rapid screening in spinal muscular atrophy smn1 gene carrier*

DENGKunyi,PENGJianming,FANHangong,LILilian,XIANGYanqun

(DepartmentofClinicalLaboratory,ZhongshanBoaiHospitalAffiliatedofSouthernMedicalUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China)

Objective To explore the potential of real-time quantitative PCR rapid screening in detecting spinal muscular atrophy (SMA) smn1 gene copy numbers and SMA carrier.Methods Twenty one carriers and 79 healthy controls confirmed by multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and 200 healthy adults were detected by real-time quantitative PCR.Results Coincidence rate of results of 21 carriers and 79 healthy controls detected by MLPA and real-time PCR were 100.0%.Of 200 healthy adults,4 cases had 1 copy of smn1,which accounted for 2.0%.And 173 had 2 copy of smn1,which accounted for 86.5%.In addition,23 had 3 copy of smn1,which accounted for 11.5%.Conclusion Real-time quantitative PCR is a fast,easy and accuracy technology for SMA carrier detection.

real-time quantitative PCR; spinal muscular atrophy; smn1

廣東省中山市科技計劃項目(20132A026)。

鄧坤儀，女，副主任技師，主要從事臨床醫學檢驗方面的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.012

A

1673-4130(2016)21-2983-02

2016-01-30

2016-04-20)