IL-17和IRF4在類風濕關節炎中的表達及臨床意義*

李茜 張國棟 劉毅, 薛麗佳 林輝

(1.西南醫科大學附屬醫院風濕免疫科， 四川 瀘州 646000；2.中南大學湘雅二醫院內科， 湖南 長沙 410083；

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·論著·

IL-17和IRF4在類風濕關節炎中的表達及臨床意義*

李茜1張國棟2劉毅1,3薛麗佳3林輝3

(1.西南醫科大學附屬醫院風濕免疫科， 四川 瀘州 646000；2.中南大學湘雅二醫院內科， 湖南 長沙 410083；

3. 四川大學華西醫院風濕免疫科， 四川 成都 610041)

目的 研究類風濕關節炎(RA)患者外周血單核細胞(PBMC)中白介素17(IL-17)、干擾素調節因子4(IRF4)的表達并探討其臨床意義。方法 收集四川大學華西醫院門診及住院RA患者30例(RA組)，根據疾病活動性評分(DAS28)分為病情活動組16例，病情穩定組14例，另選取健康自愿者20例(健康對照組)。分離外周血得到單核細胞，采用流式細胞術檢測IL-17水平，熒光定量PCR(RT-PCR)檢測IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達水平。同時將健康對照組PBMC給予Th17細胞極化條件(CD3/CD28聯合IL-6、IL-23、TGF-β，Th17細胞特異刺激組))及對照處理(CD3/CD28，對照組)培養72 h后用RT-PCR檢測IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達水平。結果 RA病情活動組IL-17水平及IL-17 mRNA和IRF4 mRNA水平高于病情穩定組(P<0.01)。病情穩定組IL-17水平及IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達水平也高于健康對照組(P<0.05)。健康對照組PBMC在Th17細胞極化條件處理培養72 h后Th17細胞特異刺激組組IL-17 mRNA、IRF4 mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05)。結論 RA患者中IL-17 mRNA與IRF4 mRNA表達水平升高，IRF4可能參與Th17細胞增加通過上調IL-17水平參與疾病發生，這可能成為RA治療的新靶點。

類風濕關節炎； 白細胞介素17； 干擾素調節因子4

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis， RA)是一種累及多關節的慢性侵蝕性滑膜炎，其中以T細胞浸潤滑膜，釋放大量細胞因子及炎癥介質，導致軟骨和骨質破壞為其主要特點[1]。目前研究發現， IL-23參與了實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發病環節[2]，并且IL-23能夠誘導一種IL-17+T細胞產生，正是這種產生IL-17+T的T細胞后來被命名為Th17細胞，其證實參與了RA的發病[2]。干擾素調節因子(interferon regulatory factor，IRF)是一組能誘導和調節干擾素及其信號通路的轉錄因子。研究發現干擾素調節因子4(IRF4)是T細胞、B細胞和漿細胞分化成熟的必要調節因子[3]。IRF4作為Th17細胞非特異性的轉錄因子，可與其他轉錄因子相互作用，調控Th17細胞分化，參與多種自身免疫性疾病[4]。本研究通過檢測RA患者外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中IL-17蛋白水平，IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達水平，以及正常人PBMC在Th17細胞極化條件下 IL-17 mRNA，IRF4 mRNA表達水平，探索IRF4調控RA Th17細胞分化機制，為RA治療提供新的潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年10月至2016年2月在華西醫院門診和住院部的RA患者30例，其中女性22例，男性8例，平均年齡(45.60±11.28)歲，均符合美國風濕病學會1987年修訂的RA診斷標準。按照疾病活動性評分(DAS28)將疾病活動性分為四級：緩解(<2.6)，輕度活動(2.6～3.2)，中度活動(3.2～5.1)和重度活動(>5.1)，并將DAS28評分為2.6～5.1的患者作為活動組(16例)，治療后病情穩定組(14例)。另選取性別和年齡匹配的健康志愿者20例為健康對照組，平均年齡(41.32±12.17)歲。

1.2 試劑與儀器 人淋巴細胞分離液Ficoll(天津灝洋生物制劑公司)，PRMI-1640培養基(美國Hyclo公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)。佛波酯、離子霉素、莫能霉素(Sigma公司)，固定破膜試劑盒(美國eBioscience公司)，CD3/CD28單抗混合劑(美國Gibco公司)，重組IL-6、IL-23、TGF-β(美國Gibco公司)，Hank’s平衡鹽溶液(美國Gibco公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(德國QIAGEN公司)，IRF4、IL-17、β-actin引物由上海英峻生物技術有限公司合成，BV510標記的CD4及同型對照(美國BD公司)，PE-Cy7標記的IL-17及同型對照(美國eBioscience公司)。FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)，實時熒光定量PCR儀CFX-96(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞術檢測PBMC中IL-17蛋白水平 收集RA組和健康對照組肝素抗凝血采用Ficoll法分離得到單核細胞。加入佛波酯(50 ng/mL)、離子霉素(500 ng/mL)及阻斷劑莫能霉素，37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養5 h。然后取出細胞懸液，用1 ml冷PBS洗滌1次，留下200 μL細胞懸液，加入BV510標記的抗人CD4抗體，孵育30 min，洗滌1次。留下100 μL細胞懸液，加入100 μL固定劑A反應20 min， 再加入透膜劑B 2 ml，洗滌2次后加入PE-Cy7標記的抗人IL-17抗體，反應30 min后洗滌1次，以250 μL預冷PBS重懸，用流式細胞儀測定，結果用Cellquest軟件分析。上述抗體反應均設置同型對照管。

1.3.2 熒光定量PCR(RT-PCR)檢測PBMC IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達水平 收集RA患者組及健康對照組PBMC后采用Trizol法提取RNA，并逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR GreenI嵌合熒光法進行定量PCR，按試劑盒說明建立PCR反應體系(總體積20 μL)。引物設計見表1。 PCR循環條件：95 ℃ 5 s → 各基因退火溫度(IRF4為61.2 ℃，IL-17為61.1 ℃，β-actin為57.0 ℃)10 s，40循環。用內參基因β-actin標準化得到-ΔCT值，采用2-ΔΔCT計算目的基因的相對表達量。

表1 β-肌動蛋白，IL-17和I RF4的引物序列

1.3.3 RT-PCR檢測Th17細胞極化條件處理后健康對照組PBMC IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達水平 收集健康對照組的PBMC后，按1×106個細胞比例接種于6孔板中，Th17細胞特異刺激組為CD3/CD28+IL-6+IL-23+TGF-β處理，對照組為CD3/CD28處理，將細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養72 h后，用RT-PCR檢測IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達水平。

2 結果

2.1 兩組PBMC中 IL-17蛋白水平的比較 流式細胞術檢測 RA組和健康對照組PBMC IL-17蛋白水平見圖1。其中病情活動組IL-17蛋白水平(1.34±0.35)顯著高于病情穩定組(0.64±0.22，P<0.01)，而病情穩定組也高于健康對照組(0.45±0.13，P<0.05)。

圖1 兩組PBMC細胞中IL-17蛋白水平

Figure 1 The levels of IL- 17 in PBMC of RA

2.2 兩組PBMC 中IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達水平比較 RT-PCR檢測兩組PBMC IL-17 mRNA，IRF4 mRNA表達水平結果顯示，RA病情活動組高于RA病情穩定組和健康對照組(P<0.05)，并且RA病情穩定組同樣高于健康對照組(P<0.05)。

表2 兩組PBMC中IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達水平

注：與穩定組相比，①P<0.01；與對照組相比，②P<0.05，③P<0.05。

2.3 PBMC在Th17細胞極化處理后IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達水平比較 RT-PCR檢測結果顯示，Th17細胞特異刺激組IL-17 mRNA，IRF4 mRNA表達水平高于對照組(P<0.05)。

Table 3 The expression of IL-17mRNA and IRF4 mRNA in different stimulation

組別IL-17mRNAIRF4mRNATh17細胞特異刺激組1.50±0.37①1.34±0.45②對照組1.04±0.290.92±0.38

注：與對照組相比，①P<0.05，②P<0.05。

3 討論

類風濕關節炎是一種以滑膜增生及關節軟骨和骨質侵蝕性破壞為特征的自身免疫性疾病。Th17細胞是一種新型輔助性T細胞，主要以分泌IL-17為特征。研究發現，RA患者外周血中IL-17水平、關節液中IL-17水平明顯升高，其中關節液中更高[5]。關節液中的IL-17與IL-17受體結合，通過MAP激酶途徑和NF-κB途徑發揮其生物學作用。IL-17可上調滑膜成纖維細胞及軟骨細胞基質金屬蛋白酶表達，誘導破骨細胞祖細胞向成熟破骨細胞分化，促進軟骨蛋白多糖及膠原降解，加重骨質及軟骨破壞[6]。IRF4作為Th17細胞的轉錄因子，雖不如RORγt特異性強，但近年在多發性硬化小鼠模型的研究中發現，通過干擾IRF4的表達可以明顯降低Th17細胞分化以及IL-17產生，從而降低疾病炎癥及臨床評分[7]。因此探討RA患者IL-17蛋白水平，IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達水平以及健康對照組的PBMC在Th17細胞極化條件下IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達水平變化，對了解RA中Th17細胞調控機制具有重要意義。

在本研究中，活動期RA患者中IL-17蛋白水平及IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達水平明顯高于RA病情穩定組及健康對照組，且病情穩定組上述指標也高于健康對照組。但RA是如何產生大量Th17細胞具體機制尚不清楚，既往大多數的研究集中在Th17細胞特異性轉錄因子RORγt[8]，而近年發現IRF4對Th17細胞分化也是必不可少的，雖然具體調節機制不清，但一些研究發現可能通過以下機制調控Th17細胞分化：①IRF4通過IL-1信號通路激活而大量表達，調節Th17細胞分化。Chung等[9]研究顯示，在Th17細胞分化早期， IL-1受體mRNA 表達水平明顯增高，IL-1通過與IL-6的協同作用促進IRF4及RORγt產生，其中IRF4增加更明顯，從而促進早期Th17細胞分化。②Mudter等[10]在實驗中發現IRF4可與STAT3共同誘導RORγt表達，增強RORγt誘導Th17細胞產生的能力，從而間接調控Th17細胞分化。進一步研究發現當IRF4缺乏時，T細胞中RORγt表達降低，IL-17水平降低，即使上調RORγt也只能部分恢復Th17細胞的分化[11]。③此外還有研究報道在腸道黏膜中IRF4能通過CD103+CD11b+ DC細胞產生IL-6來促進腸道Th17細胞分化，當CD103+CD11b+ DC細胞缺乏IRF4時，不僅會影響樹突狀細胞分化同樣IL-17水平也同時降低[12-13]。

本實驗中在體外培養健康對照組PBMC中發現CD3/CD28聯合IL-6、IL-23、TGF-β刺激后IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達水平較對照組明顯升高。既往研究也證實，CD3/CD28可協同促進Th17細胞產生，IL-6和TGF-β是促進初始CD4+T細胞分化為Th17細胞所必需的[14-15]，IL-23對維持Th17細胞增殖也十分重要[16]。在Th17細胞極化條件下，不僅IL-17 mRNA水平升高，而IRF4 mRNA水平也增加，間接表明IRF4與Th17細胞增多有關，IRF4參與了Th17細胞的轉錄調控。這和Huber等[17]的研究結果一致，其發現在體外Th17細胞極化條件下，IL-6可誘導IL-21產生，而IRF4通過IL-21促進Th17細胞分化，此外IL-21在IRF4維持Foxp3, RORα，RORγt平衡中起關鍵性作用。

4 結論

RA患者病情活動組中存在高水平IL-17 mRNA、 IRF4 mRNA表達，并且體外培養健康對照組PBMC在Th17細胞特異性刺激下IL-17 mRNA、IRF4 mRNA的表達水平也明顯升高，這進一步說明IRF4作為Th17細胞的間接調控轉錄因子參與了RA的發病機制。因此，通過深入研究IRF4對RA Th17細胞的調控機制，可能為RA Th17細胞的靶向治療提供新的靶點。

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Expression and significance of IL-17 and IRF4 in patients with rheumatoid arthritis

LI Xi1, ZHANG Guodong2, LIU Yi3, et al

(1.DepartmentofRheumatologyandImmunology，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000,Sichuan,China;2.DepartmentofInternalMedicine,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity，Changsha410083,China;3.DepartmentofRheumatologyandImmunology，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041,China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of IL-17 and IRF4 in patients with rheumatoid arthritis (RA). Methods 30 RA patients were divided into active RA patients (16 cases) and stable RA patients (14 cases). 20 healthy people were taken as the healthy controls (HC). The peripheral blood monocyte cells (PBMC) from HC and RA patients were collected. The levels of IL- 17 were measured by flow cytometry. The expression levels of IL- 17mRNA and IRF4 mRNA in HC and RA patients were measured by real-time PCR (RT- PCR). The PBMC from HC were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibodies in the absence or presence of IL-6、IL-23 and TGF-β. After co-culture, the levels of IL-17mRNA and IRF4mRNA were analyzed by RT- PCR. Results The levels of IL-17, IL-17mRNA and IRF4 mRNA of RA stable patients were significantly higher than that of active RA patients(P<0.01)．The levels of IL-17, IL-17mRNA and IRF4 mRNA in RA stable patients were higher than that of HC (P<0.05). Under A-CD3/A-CD28+IL-6+IL-23+TGFβ stimulated PBMC the expression of IL- 17mRNA, IRF4 mRNA were all higher than that of controls (A-CD3/ A-CD28) (P<0.05).Conclusion IL- 17mRNA and IRF4 mRNA in RA patients are highly expressed. IRF4 may play an important role in the development of RA. IRF4 may regulate the differentiation of Th17 cells, which makes IRF4 to be potential target for RA therapy.

Rheumatoid arthritis; IL-17; Interferon regulatory factor 4

國家自然科學基金(81102274)；四川省科技廳國際合作項目(2014HH0027)；成都市科技攻關項目(10GGYB644SF-023)

劉毅，教授，博士生導師，本刊常務編委，E-mail：yi2006liu@163.com

R 593.22

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.007

2016-07-01；

2016-08-13； 編輯： 張文秀)