TWEAK及IL-17在強直性脊柱炎發病中的作用*

楊婧 孫紅兵 帥世全 李夢蘭 劉劍平 陳悅 李天紅

(1.南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床學院風濕免疫科， 四川 南充 637000；2.川北醫學院附屬醫院風濕免疫科， 四川 南充 637000)

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·論著·

TWEAK及IL-17在強直性脊柱炎發病中的作用*

楊婧1孫紅兵1帥世全1李夢蘭1劉劍平2陳悅1李天紅1

(1.南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床學院風濕免疫科， 四川 南充 637000；2.川北醫學院附屬醫院風濕免疫科， 四川 南充 637000)

目的 通過檢測腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子(TWEAK)在強直性脊柱炎(AS)患者外周血單個核細胞及血漿中的表達情況并探討其臨床意義，為AS的早期診斷及治療尋找新方法。方法 采用免疫熒光方法測定AS患者與健康體檢者外周血單個核細胞中TWEAK蛋白水平的表達情況，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測AS患者及健康對照者血漿中TWEAK及IL-17水平，分析TWEAK與IL-17、CRP、ESR相關性。結果 TWEAK廣泛表達于AS患者和健康對照者外周血單個核細胞，疾病活動期AS患者血漿中TWEAK水平比健康對照者明顯增高，AS患者血漿IL-17水平較健康對照者明顯升高，AS疾病活動期患者血漿IL-17水平較AS疾病非活動期患者明顯升高。相關性分析結果顯示疾病活動期AS患者血漿TWEAK水平與IL-17、CRP、ESR水平均無明顯相關性，疾病活動期AS患者血漿IL-17水平與CRP、ESR水平均無明顯相關性。結論 TWEAK及IL-17在AS發病中起重要作用，可能參與了AS的發病機制。

TWEAK； 強直性脊柱炎； IL-17

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是風濕免疫科最常見的疾病之一[1-2]，其發病機制目前尚不明確，目前認為多種細胞因子參與其發病過程。腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)作為一種腫瘤壞死因子超家族的新成員，在風濕性疾病發病機制中的作用越來越受到人們的關注，其在類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)發病機制中的作用已得到證實，但在AS脊發病機制中的研究目前仍較少。有文獻報道RA患者血清中TWEAK水平較正常對照組明顯升高，并與RA疾病活動性相關，但AS患者血清中TWEAK水平較正常對照組無明顯增高[3]。IL-17作為一種新的細胞因子，近年來其在風濕性疾病發病機制中的作用越來越受到重視，越來越多研究表明其與AS發病密切相關[4]。為了探究TWEAK及IL-17在AS發病機制中的作用，本實驗通過免疫熒光方法測定AS患者與健康對照者外周血單個核細胞中TWEAK蛋白水平的表達情況,ELISA方法檢測AS患者血漿中TWEAK及IL-17水平，收集所有AS患者的臨床資料和ESR、CRP等實驗室指標，分析IL-17水平及TWEAK表達水平與AS疾病活動度、實驗室檢查的相關性，初步探討TWEAK在AS發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 46例AS患者均為門診及住院診斷AS明確的患者，其中男36例，女10例，入組年齡18～55歲，平均(34±10)歲，診斷標準參照美國風濕病學會(ACR)1984年修訂的紐約標準[5]，排除心、肝、腎、內分泌疾病和腫瘤。所有AS患者按疾病活動指數(BASDAI)評分[6]分為兩組：活動期組24例(BASDAI≥4或脊柱痛VAS≥4)，非活動期組22例(BASDAI<4或脊柱痛VAS<4)。兩組AS患者近1個月內均未使用激素以及免疫抑制劑，同時收集所有AS患者的臨床資料和ESR、CRP等實驗室檢查指標。34例年齡、性別與AS患者匹配的健康體檢者納入正常對照組，其中男23名，女11名，年齡22～45歲，平均年齡(32±6)歲。所有受試對象均知情同意并自愿參加本研究。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑與儀器 Ficoll人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司)，ELISA試劑盒(美國R&D公司)，FITC標記山羊抗兔IgG二抗(ZF-0311，北京中杉金橋公司), 兔抗人TWEAK單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，Immage免疫分析儀(美國Beckman公司)。

1.2.2 標本采集及處理 所有病例均空腹抽取外周靜脈血5 ml，肝素抗凝，2000 r/min離心5 min分離血漿，-80 ℃保存ELISA備用，余血用Ficoll人淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞(PBMC)，調整細胞濃度至1×105/mL，取100 μL調整后的細胞懸液涂片，用4%多聚甲醛固定20 min，用PBS洗凈后晾干，4 ℃冰箱保存。

1.2.3 實驗室檢測指標的測定 ESR按魏氏法進行操作，CRP的檢測用速率散射比濁法測定其水平。

1.2.3 血漿TWEAK及IL-17水平的檢測 血漿TWEAK及IL-17水平的檢測均采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，操作步驟嚴格按照說明書進行，在酶標儀上以450 nm為測量波長測定其吸光度值(OD值)，以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，根據曲線計算待測樣品中TWEAK及IL-17的濃度。

1.2.4 間接免疫熒光細胞化學染色法檢測外周血單個核細胞中TWEAK蛋白水平的表達 將細胞涂片從4 ℃冰箱取出，室溫條件下平衡15 min，TPBS洗滌5 min×3次，0.5% Triton X-100透膜20分鐘，TPBS洗滌5min×3次，3%BSA工作液封閉30 min，滴加1∶100稀釋的兔抗人TWEAK單克隆抗體4 ℃濕盒內孵育過夜，取出后平衡至室溫，TPBS洗滌5 min×3次，滴加1∶100稀釋的山羊抗兔熒光標記二抗，50%甘油-PBS封片劑封片，立即在熒光顯微鏡下觀察TWEAK表達情況并照相，每批免疫熒光均設定陽性和陰性對照。

2 結果

2.1 TWEAK在外周血單個核細胞中的表達情況 間接免疫熒光細胞化學染色法檢測TWEAK在46例AS患者和34例健康對照者外周血單個核細胞的表達情況，結果顯示TWEAK是一種跨膜表達的綠色熒光蛋白，廣泛表達于AS患者和健康對照者外周血單個核細胞。其中46例AS患者TWEAK的陽性率為78.3%(36/46)，34例健康對照者中TWEAK的陽性率為67.6%(23/34)，TWEAK在AS組的陽性表達率高于健康對照組，但兩組間的差異無統計學意義(P>0.05)。TWEAK在外周血單個核細胞中的表達見圖1及圖2。

2.2 血漿TWEAK 及IL-17水平的檢測結果 ELISA結果顯示AS組血漿TWEAK水平為(504.82±121.54) pg/mL，健康對照組為(475.64±79.31) pg/mL，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。但是24例活動期AS患者血漿TWEAK水平(521.93±85.36 pg/mL)比健康對照組(475.64±79.31) pg/mL高，差異有統計學意義(P<0.05)。24例活動期AS患者血漿TWEAK水平(521.93±85.36) pg/mL與22例非活動期組AS患者血漿TWEAK水平(486.16±151.58) pg/mL比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 TWEAK陽性表達

Figure 1 Positive expression of TWEAK

圖2 TWEAK陰性表達

Figure 2 Negative expression of TWEAK

AS患者和健康對照者血漿IL-17水平分別為(10.21±3.83)pg/mL和(5.67±1.68)pg/mL，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。24例活動期AS患者血漿IL-17水平(12.24±3.62) pg/mL比22例非活動期組AS患者血漿IL-17水平(8.00±2.68) pg/mL升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 血漿TWEAK水平、IL-17水平、ESR、CRP等各項指標的相關性分析 活動期AS患者血漿TWEAK水平與IL-17、ESR、CRP三個指標之間進行相關性分析，TWEAK與三者均無相關性，AS患者血漿IL-17水平與ESR、CRP之間進行相關性分析，IL-17與兩者均無相關性見表1和2。

表1 AS活動期組TWEAK與IL-17、ESR及CRP相關性分析

Table 1 The analysis of correlation between TWEAK and other indexes in active stage AS patients

項目IL-17ESRCRPr0.0780.285-0.029P0.7160.1770.894

表2 AS活動期組IL-17與ESR、CRP相關性分析

Table 2 The analysis of correlation between IL-17 and other indexes in active stage AS patients

項目SRCRPr-0.096-0.009P0.6550.968

3 討論

AS是一種慢性、進行性炎癥性疾病，主要侵犯骶髂關節、脊柱、脊柱旁肌腱、軟組織及外周關節，引起脊柱強直，并可伴發關節外表現。免疫介導的炎癥反應貫穿于AS發生、發展的整個過程，包括多種細胞因子參與其炎癥反應過程，其中白介素(IL)及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)在 AS 疾病發生、發展過程中發揮著重要作用。因此，針對白介素及TNF的拮抗治療對AS的臨床治療具有重要的意義。

TWEAK是腫瘤壞死因子超家族新發現的成員，是一種多功能性的細胞因子，與TNF的作用相似，通過與其受體Fn14特異性結合發揮誘導細胞增殖、遷移和凋亡，調節血管內皮細胞增生[7]，促進炎癥反應，調節機體免疫等多種生物學功能。TWEAK不僅參與腫瘤及各種急慢性炎癥性疾病的發病過程，其在風濕性疾病中的作用越來越受到重視，可能是風濕性疾病中一個新的炎癥介導者。研究表明不僅血清中TWEAK水平與系統性紅斑狼瘡疾病活躍程度相關[8]，而且外周血單個核細胞中TWEAK水平[9-10]及尿液中TWEAK水平[11]與狼瘡腎炎的疾病活躍程度亦相關。在皮膚血管炎性疾病發病機制中TWEAK通過誘導生成趨化因子發揮作用[12]。系統性硬化癥患者血清TWEAK水平明顯升高，說明TWEAK與系統性硬化癥病情有密切關系[13]。Park等[3]研究發現RA患者血清TWEAK、TNF-α、IL-16水平明顯高于健康對照組，TWEAK水平與RA疾病活動性呈相關，經依那西普治療后TWEAK水平明顯降低。TWEAK在RA患者關節液及滑膜組織中表達明顯升高，TWEAK/Fn14通路在RA關節炎癥及骨破壞發病機制中起重要作用[14]。TWEAK還能抑制軟骨形成和骨的再生，促進破骨細胞分化，阻礙內源性修復機制[15]；AS的病理基礎是關節軟骨和骨的破壞及附近骨質的硬化， TWEAK可能在AS發病機制中同樣發揮作用。研究發現銀屑病患者血清TWEAK、IL-6、IL-23及TNF-α水平明顯升高，但與病情嚴重程度無明顯相關性，表明TWEAK與銀屑病發病機制有一定相關性[16]。也有研究發現[17]銀屑病關節炎患者血清TWEAK水平明顯升高，并與其病情活動度相關；同樣研究發現[18]，TWEAK在類風濕關節炎患者和銀屑病關節炎患者的關節滑膜上都有大量表達，這些都表明了TWEAK與血清陰性脊柱關節病的相關性。

目前TWEAK與AS相關研究較少，本研究前期工作表明TWEAK在AS患者和健康對照者血漿中的表達情況進行比較差異無統計學意義[19]，與Park等[3]文獻報道的AS患者血清中TWEAK水平與正常對照組比較增高不明顯這一結論基本一致，但是,活動期AS患者血漿TWEAK水平比正常對照組明顯升高，并且TWEAK與TNF-α有相關性，提示TWEAK可能與AS疾病活動性有關，參與AS的炎癥反應過程。本研究進一步證實TWEAK是一種跨膜表達的綠色熒光蛋白，廣泛表達于AS患者和健康對照者外周血單個核細胞，但是其在AS組及健康對照組表達的差異無統計學意義，TWEAK在AS活動期及非活動期AS患者血清中水平水平無明顯差異。本研究通過對血漿TWEAK水平與IL-17、ESR、CRP等水平各項指標的相關性分析，結果顯示TWEAK與IL-17、ESR、CRP均無相關性，目前在AS中TWEAK與IL-17水平、ESR、CRP是否具有相關性研究甚少。TWEAK在AS發病機制中的作用本實驗最終并沒有得到滿意的結論，認為原因可能是樣本量小影響了實驗結果，目前TWEAK在AS發病機制中的作用尚不明確，仍需要加大樣本量進一步研究證實。

IL-17 是由輔助性T細胞17分泌的特殊性細胞因子,具有十分復雜的生物學功能,越來越多的研究表明IL-17參與多種自身免疫性疾病的發病，如類風濕關節炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、硬皮病等[20-21]。IL-17在強直性脊柱炎中不僅參與其發病過程，且與其疾病活動性及嚴重程度相關[4]。本研究發現AS患者較健康對照者血漿IL-17水平明顯升高，兩組比較差異有統計學意義。活動期AS患者血漿IL-17水平比非活動期AS患者血漿IL-17水平明顯升高，有統計學意義。但是IL-17與ESR、CRP之間進行相關性分析，IL-17與兩者均無相關性。但IL-17與ESR、CRP之間究竟是否有相關性，相關性如何，尚需更大臨床樣本量的研究證實。

4 結論

TWEAK及IL-17在AS發病機制中的有重要作用，參與了AS的發病過程， 但其與AS 關系復雜，其在AS發病中的意義仍需進一步加大樣本量研究證實。

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Preliminary study of the roles of TWEAK and IL-17 in the pathogenesis of ankylosing spondylitis

YANG Jing1, SUN Hongbing1, SHUAN Shi-quan1, et al

(1．DepartmentofRheumatism,NanchongCentralHospital·TheSecondClinicalMedicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China；2．DepartmentofRheumatism,TheAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective To investigate the expression lever of TWEAK in blood serum and peripheral blood mononuclear cell from patients with ankylosing spondylitis (AS) and to explore the clinical significance in AS and explore new methods for the early diagnosis and treatment of AS. Methods The expressions of TWEAK protein level in peripheral blood mononuclear cells was detected by immunofluorescence. The expressions of TWEAK and IL-17 was measured by enzyme-linked immuno sorbent assay in patients with AS and healthy persons. The relationship between TWEAK level and clinical data of the patients were evaluated. Results TWEAK is widely expressed in peripheral blood mononuclear cells of AS patients and healthy controls. The serum levels of TWEAK in active stage AS patients increased significantly, compared to healthy controls. The serum levels of IL-17 in AS patients increased significantly, compared to healthy controls. The serum levels of IL-17 in active stage AS patients increased significantly, compared to non-active stage AS patients. There was no correlation between TWEAK and IL-17,CRP, ESR. There was no correlation between IL-17 and CRP, ESR. Conclusion The TWEAK and IL-17may play a critical role in the development of AS, and involved in the pathogenesis of AS.

TWEAK； Ankylosing spondylitis； IL-17

四川省衛生廳科研課題(120281)

帥世全，教授，本刊編委，E-mail：shuaishiquan@126.com

R 593.23

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.021

2016-07-01；

2016-08-13; 編輯： 黎仕娟)