B淋巴細胞微粒在類風濕關節炎患者外周血和關節液中的表達及臨床意義*

薛麗佳 黃巧容 林輝 崔貝貝 李茜 劉毅

(1.四川大學華西醫院風濕免疫科， 四川 成都 610041；2.四川大學華西醫院干細胞生物學研究室， 四川 成都 610041；3.西南醫科大學附屬醫院風濕免疫科, 四川 瀘州646000)

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·論著·

B淋巴細胞微粒在類風濕關節炎患者外周血和關節液中的表達及臨床意義*

薛麗佳1黃巧容2林輝1崔貝貝1李茜3劉毅1

(1.四川大學華西醫院風濕免疫科， 四川 成都 610041；2.四川大學華西醫院干細胞生物學研究室， 四川 成都 610041；3.西南醫科大學附屬醫院風濕免疫科, 四川 瀘州646000)

目的 探討B淋巴細胞微粒(B-LMPs)在類風濕關節炎(RA)發病機制中的作用。方法 采用流式細胞術檢測39例活動期RA患者(RA組)和24例健康體檢者(健康對照組)外周血B-LMPs含量，檢測RA患者外周血CRP、 ESR、RF、ACPA指標，分析B-LMPs含量與各指標相關性。其中20例有膝關節積液RA患者(關節液組)同時檢測配對外周血和關節液B-LMPs含量。結果 RA患者外周血B-LMPs含量顯著高于健康對照組(P<0.01)；RA患者關節液B-LMPs含量明顯高于配對外周血(P<0.05)。RA患者外周血B-LMPs含量與疾病活動性評分DAS28呈正相關(r=0.5431,P=0.0009),與ESR、CRP、RF、ACPA無相關性；而關節液B-LMPs含量與疾病活動性評分DAS28呈負相關(r=-0.470，P=0.0362)，與CRP、ESR、RF、ACPA無相關性。結論 RA患者外周血B-LMPs表達異常，且與疾病活動性顯著相關，提示B-LMPs在RA疾病活動和關節損害中發揮重要作用。

類風濕關節炎；B淋巴細胞微粒；流式細胞技術；關節液

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是風濕免疫科常見的自身免疫性疾病，以對稱性關節破壞為主要表現，伴隨慢性、進行性、侵襲性發病為主要特征[1-2]。既往研究認為RA的發病與免疫細胞活化和細胞因子參與有關；深入的研究發現，免疫細胞活化或凋亡可以分泌一種電鏡下直徑介于100～1000 nm的超微囊泡顆粒，稱之為細胞微粒(cell-derived microparticles，MPs)[3],其具有源細胞表面抗原、蛋白質、核酸，還能參與體內炎癥反應、凝血、新生血管生成以及傳遞生長因子等。根據這些MPs來源不同可分為血小板微粒(Platelet microparticles, PMPs)、內皮細胞微粒(Endothelial microparticles, EMPs)、單核細胞微粒(Monocyte microparticles, MMPs)以及淋巴細胞微粒(lymphocyte microparticles, LMPs)[4]等，LMPs又可以進一步分為B淋巴細胞微粒(B-LMPs)和T淋巴細胞微粒(T-LMPs)。

LMPs是由活化或凋亡的淋巴細胞出芽脫落形成的一種超微囊泡結構，靜息狀態下，細胞膜內層帶負電荷的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺組成[5]，當細胞受到活化和外界刺激時，鈣離子進入細胞內，影響細胞膜上的氨基磷脂特異性移位酶、非特異性脂質翻轉酶、非特異性脂質爬行酶、鈣離子依賴蛋白酶活性，隨著磷脂酰絲氨酸翻轉到細胞膜外層，細胞骨架發生伸展變形[6]，最終形成LMPs。LMPs能表達淋巴細胞表面標記物CD3、CD4、CD8、CD20，但是T-LMPs不能表達CD28和CD45[7]。有研究發現LMPs具有免疫調節、調控血管生成和調節血管張力等作用，在心血管疾病和糖尿病中均檢測到LMPs的存在[8]。對于B-LMPs參與RA的發病炎癥機制，國內研究較少，本研究通過比較RA患者外周血和關節液B-LMPs數量的變化，探索B-LMPs在RA發病中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2014年12月至2015年7月四川大學華西醫院風濕免疫科病房或門診中重度活動期RA患者39例，其中女性34例，男性5例，平均年齡(48.95±14.30)歲。所有患者均符合1987年美國風濕病學會(ACR)修訂的RA診斷標準或2010年歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)RA分類標準。疾病活動度判斷采用疾病活動指數28(DAS28)，以DAS28≥3.2為疾病中重度活動。入選患者平均DAS28為(5.04±1.15),其中20例抽取膝關節液，標本采集前1個月患者未服用改善病情抗風濕藥(disease modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)，未服用激素或口服低劑量激素(潑的松≤10 mg/d)。另納入24例無免疫性疾病及近期感染史的健康體檢者作為對照組，性別與年齡均匹配，其中女性19例，男性5例， 平均年齡(42.75±8.62)歲。健康組無關節積液。排除標準： ①急慢性感染；②惡性腫瘤；③合并或重疊其他結締組織病；④糖尿病；⑤伴有過敏、哮喘等其他變態反應性疾病；⑥心血管疾病；⑦懷孕或哺乳患者。本研究獲得四川大學華西醫院醫學倫理委員會批準，且取得受試者的知情同意。

1.2 試劑與儀器 APC-抗人Annxin V購自美國eBioscience公司，PECR-Cy5.5-抗人CD20抗體及相應同型對照抗體(美國Beckon-Dickinson公司)； Annexin V Binding Buffer(10×)購自美國Beckon-Dickinson公司；絕對計數熒光微球試劑盒購自美國 Beckman Coulter公司；黃色納米熒光標準試劑盒, 流式細胞級別購自美國Spherotech公司。FACS Aria流式細胞儀購自美國BD公司，TCL-16高速離心機購自中國湘儀公司，不銹鋼換膜過濾器購自美國Millipore公司。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料 詳細記錄每個RA患者的年齡、性別、病程、腫脹關節數(SJC)、壓痛關節數(TJC)。

1.3.2 檢測ESR、CRP、RF和ACPA水平 取RA患者清晨空腹靜脈血以枸櫞酸鈉3.7 ml抗凝，同時無菌操作抽取RA患者的膝關節液5 ml至枸櫞酸鈉抗凝管中，分別采用魏氏法檢測血沉(ESR)水平，速率散色比濁法檢測C反應蛋白(CRP)和類風濕因子(RF)水平，ELISA法檢測抗環網氨酸肽抗體(ACPA)水平。

1.3.3 流式細胞儀檢測RA患者外周血和關節液B-LMPs數量 分別取外周血和關節液樣本10 μL，加入1 μL APC標記的抗人Annxin V抗體和1 μL Annexin V Binding Buffer(10×)，避光孵育10 min后，加入1 μL PECR-Cy5.5標記的抗人CD20抗體，室溫下避光孵育30 min，同時設同型對照反應管，以150 μL Annexin V Binding Buffer(1×)重懸細胞，并加入絕對計數熒光微球漩渦震蕩后上流式細胞儀檢測。

1.4 統計方法 采用SPSS22.0統計軟件進行統計分析，兩獨立樣本之間采用非參數檢驗Mann-WhitneyU檢驗；兩配對樣本之間采用非參數檢驗Wilcoxon符號秩檢驗；Spearman直線相關分析及線性回歸分析RA患者外周血、關節液MPs的水平與病情活動指標相關性，以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料比較 RA組和關節液組在年齡、性別、病程、壓痛關節數(TJC)、腫脹關節數(SJC)、ESR、CRP、RF陽性率、ACPA陽性率、DSA28率方面差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 RA患者與健康對照組外周血B-LMPs比較 RA患者外周血B-LMPs表達水平高于健康對照組(P<0.01)，RA患者關節液B-LMPs表達水平顯著高于配對關節液外周血(P< 0.05)，見表2。

2.3 RA患者外周血、關節液B-LMPs與臨床指標相關性分析 RA患者外周血B-LMPs數量與DAS28呈正相關(r=0.5431,P=0.0009)，與ESR、CRP、RF、ACPA無相關性；而關節液B-LMPs 數量與DAS28呈負相關(r=-0.4707,P=0.0362)，與CRP、ESR、RF、ACPA無相關性，見表3。

表1 臨床資料比較

注：RA: 類風濕關節炎； SF:關節液; SJC:腫脹關節數; TJC: 壓痛關節數; ESR: 血沉; CRP:C-反應蛋白； RF: 類風濕因子; Anti-CCP: 抗環瓜氨酸肽抗體；DAS 28: 28個關節活動度指標。

表2 4組B-LMPs檢測值

注：與健康對照比較，①P<0.01；與配對關節液比較，②P<0.05

表3 RA患者B-LMPs與臨床指標相關性分析

Table 3 Correlation of B-LMPs counts in plasma of RA patientsand synovial fluid of RAwith clinical parameters

患者外周血B-LMPsrP患者關節液B-LMPsrPDAS280.54310.0009①-0.47070.0362②CRP-0.27170.0943-0.21540.3618ESR0.09700.5569-0.38140.1072RF-0.07830.67020.66020.8303ACPA0.13100.43950.10280.6849

注：①P<0.05;②P<0.05。

3 討論

RA的發病伴隨各種炎癥反應和免疫細胞活化，在關節滑膜處炎性因子的浸潤，最終導致關節破壞是RA的主要臨床特點。近年來隨著MPs的研究深入，發現其不僅是一種細小的碎片，更具有生物學活性物質，參與細胞間信號傳遞、免疫調節、炎癥反應等[10]；來源于活化B淋巴細胞的B-LMPs，在某種程度上也參與了RA的免疫調控階段[15]。

已有研究發現，B-LMPs能誘導單核細胞產生炎癥因子IL-1和TNF-α，介導慢性炎癥。Baka等[12]在皮肌炎和多肌炎患者外周血檢測到T-LMPs和B-LMPs數量明顯增加，且與抗JO-1抗體、肺損傷程度相關，提示LMPs可能參與炎性肌病的發病。有研究表明，硬皮病患者外周血中PMPs、LMPs及EMPs含量均升高[13- 14]。Berckmans等[15]最早研究了RA患者外周血和關節液中的細胞微粒，其中關節液中B-LMPs含量約為(10～304)×106/L，與外周血(10～31)×106/L相比，差異無統計學意義，在RA關節液中仍以T-LMPs和MMPs為主。本研究發現RA患者外周血中B-LMPs的含量顯著高于健康對照組，而Berckmans等[15]的研究則未觀察到差異存在。既往有報道LMPs可以通過巨噬細胞調節免疫反應，當LMPs被小鼠單核細胞白血病RAW264.7細胞吞噬后，誘導其凋亡，巨噬細胞得到活化繼而釋放炎癥因子[16]。LMPs在調節血管生成方面同時具有抑制和促進兩種功能，低濃度的LMPs能減少內皮細胞上一氧化氮的產生，這一過程依賴P13K途徑，從而導致內皮細胞損害和血管生成受損，而高濃度LMPs能直接改善內皮細胞的功能，一方面，LMPs增加血管內皮生長因子、IL-1β、細胞粘附分子的表達，促進一氧化氮釋放和促進血管生成[17-19]。另一方面， LMPs表達音猬因子(sonic hedgehog，shh)基因、shh蛋白，作用于血管內皮生長因子。Distler等[20]發現，LMPs促進關節滑液中成纖維細胞金屬基質蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、MMP-3 、MMP-9、MMP-13的表達。

本研究發現RA患者外周血中B-LMPs含量均顯著高于健康對照組，提示B-LMPs參與了RA的免疫反應，而RA患者關節液中B-LMPs含量較外周血相比明顯增高，B-LMPs作用與滑膜成纖維細胞，釋放眾多炎癥因子，進一步吸引白細胞聚集在關節腔中產生炎癥反應。由于RA患者關節液中的B-LMPs作用于滑膜成纖維細胞，釋放IL-6、IL-8、單核細胞趨化因子(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)以及MCP-2，進一步吸引白細胞聚集在關節腔中產生炎癥。這與我們觀察到外周血B-LMPs與疾病活動度DAS28呈正相關，而RA關節液中B-LMPs與疾病活動度DAS28呈負相關一致，推測B-LMPs可作用與滑膜成纖維細胞相互作用，升高的炎癥因子在某種程度上會抑制炎癥因子的產生。

4 結論與啟示

本研究結果顯示，RA患者外周血中B-LMPs水平與炎癥指標密切相關，在一定程度上反映了體內炎癥水平，但尚需探索B-LMPs水平與RA局部關節破壞的關系，PMPs的檢測對RA早期診斷和病情監測具有重要的臨床價值。PMPs不僅參與血栓形成和動脈粥樣硬化，在RA炎癥反應及免疫調節中也發揮了重要作用。

目前有關B-LMPs在炎癥狀態下的病理生理特性，B-LMPs對RA的影響機制尚不十分明確，未來還將探討B-LMPs功能以及與其他免疫細胞的相互作用，從而為深入認識RA分子機制，尋找新的RA治療靶點提供依據。

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Association of elevated B-lymphocyte Microparticles with disease activity in rheumatoid arthritis

XUE Lijia1,HUANG Qiaorong2,LIN Hui2,et al

(1.DepartmentofRheumatologyandImmunology,WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China;2.LaboratoryofStemCellBiology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;3.DepartmentofRheumatologyandImmunology，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000,Sichuan,China)

Objective To test the expression of B-lymphocyte Microparticles (B-LMPs) in rheumatoid arthritis (RA) patient’s plasma and synovial fluid and compare the difference between patients and healthy controls (HC).Methods The levels of B-LMPs in plasma were detected by flow cytometry in 39 active RA patients and 24 healthy volunteers. Synovial fluid (SF) was collected from 20 patients. Clinical parameters including CRP, ESR, RF, ACPA in the patients and volunteers were observed and analyzed. The potential correlation of B-LMPs counts and clinical parameters was analyzed. Results The B-LMPs levels in SF from RA patients were higher than paired plasma (P<0.05) and in plasma from HC (P<0.01). The levels of plasma B-LMPs were positively correlated with Disease Activity Score DAS28 (r=0.5431,P=0.0009) and not correlated with ESR, CRP, RF and ACPA. B-LMPs levels in SF were not correlated DAS28, ESR, CRP, RF and ACPA (P>0.05). Conclusion B-LMPs may be involved in immune regulation and systemic inflammation of RA. The elevated levels of PMPs could be a potential biomarker for RA.

Rheumatoid arthritis; Flow cytometry; B-lymphocyte Microparticles; Synovial fluid

國家自然科學基金(81102274)；四川省科技廳國際合作項目(2014HH0027)；成都市科技攻關項目(10GGYB644SF-023)

林輝，博士，副主任醫師，本刊審稿專家，E-mail：lhacd@163.com

R 593.22

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.006

2016-07-01；

2016-08-13； 編輯： 黎仕娟)