碘液在芽孢染色中的應用研究*

金曉琳，金浩龍，侯 瑞，熊 坤，陳志瑾△

（1.第三軍醫大學微生物學教研室，重慶400038；2.第三軍醫大學新橋醫院感控科，重慶400037；3.第三軍醫大學免疫學教研室，重慶400038）

·臨床研究·

碘液在芽孢染色中的應用研究*

金曉琳1，金浩龍2，侯 瑞3，熊 坤1，陳志瑾1△

（1.第三軍醫大學微生物學教研室，重慶400038；2.第三軍醫大學新橋醫院感控科，重慶400037；3.第三軍醫大學免疫學教研室，重慶400038）

目的 探尋一種滿意的芽孢染色方法，同時該方法能克服染料加溫后揮發給實驗操作人員帶來的身體傷害。方法 以碘液為媒染劑，用冷染方法替代傳統芽孢加溫染色，然后進行細菌涂片、干燥、固定、染色。初染液為石炭酸復紅5 min，碘液媒染1 min，95%乙醇脫色5 s，堿性美蘭復染1 min。比較石炭酸復紅染色后加碘液、石炭酸復紅染色不加碘液、石炭酸復紅加溫染色不加碘液的染色效果。結果 石炭酸復紅染色后加碘液與石炭酸復紅加溫染色不加碘液的染色效果相同，石炭酸復紅染色不加碘液也能看出芽孢，但不明顯。結論 用碘液助染可獲得滿意的芽孢染色結果，且用該法可減少石炭酸揮發給實驗操作人員帶來的危害。

碘； 染色與標記； 芽孢桿菌屬/化學； 苯酚

經典的芽孢染色法為Schaeffer-Fulton方法（微生物學家Alice B.Schaeffer和Macdonald Fulton在20世紀30年代建立）和Wirtz-Conklin方法（Robert Wirtz和Marie E.Conklin是20世紀早期的細菌學家），即采用石碳酸（苯酚）復紅染液或孔雀綠進行芽孢染色，在加溫條件下染5 min才能將芽孢染上顏色，然后水洗，用堿性美蘭、番紅或沙黃復染。這種加溫助染的方法稱為熱染法。但眾所周知，石碳酸是苯酚，具有明顯揮發性，在加溫條件下促進了石碳酸的揮發，對人體皮膚、黏膜具有明顯刺激。人們在使用石碳酸加溫促染時會感覺到眼睛和鼻部受到的刺激。再者含苯環的芳烴類物質被認為具有致癌性，孔雀綠也具有高毒素、高殘留、致癌、致畸、致突變等作用。本研究建立了一種應用碘液助染，避免應用加熱助染的芽孢冷染法，芽孢染色效果好，且避免了石碳酸加熱產生大量刺激性氣體對操作人員健康的損害。將這種染色法稱為芽孢冷染法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 采用枯草芽孢桿菌于牛肉蛋白棟培養基上37℃培養48 h的斜面培養物。

1.1.2 器材 干凈的玻璃載玻片、乙醇燈、顯微鏡、鏡油、蠟筆、接種環、10 μL加樣器、吸水紙、Nikon Eclipse Boi顯微鏡、照相軟件[Nls-Elements、BR3.2（Bulid710）、Nikon Ds-U2/L2 USB]等。

1.1.3 試劑 （1）0.9%氯化鈉溶液：0.900g氯化鈉加蒸餾水100 mL定溶。（2）革蘭碘液：碘片0.500 g，碘化鉀1.000g，蒸餾水150 mL定溶。（3）95%乙醇為分析純。（4）石炭酸復紅：①稱7.600 g堿性復紅（品紅）溶于200 mL 95%乙醇中，放置 2 d。②稱 90.000 g石炭酸（苯酚）溶于1 800 mL蒸餾水中配成石炭酸水溶液。將1份堿性復紅乙醇飽和液與9份5%石炭酸水溶液混合配成石炭酸復紅液。（5）美蘭液：300 mL 95%乙醇加5.328 g亞甲基藍即為飽和原液，于300 mL美蘭原液中加10 mL 1%氫氧化鉀再加1 000 mL蒸餾水即為堿性美蘭液。

1.2 方法 用蠟筆在15張玻璃載玻片邊緣編號，載玻片上分別滴加0.9%氯化鈉溶液5 μL，用接種環無菌操作轉移枯草桿菌到載玻片上，涂片，自然干燥，用乙醇燈外焰加熱固定。（1）石炭酸復紅染色后加碘液：1～5號玻片菌膜上加石炭酸復紅液染5 min，水洗，加碘液1 min，水洗，用95%乙醇脫色，從紅色至液體為無色，堿性美蘭液染1 min，水洗，吸水紙吸干玻片上多余的水分，鏡檢。（2）石炭酸復紅染色不加碘液：6～10號玻片菌膜上加石炭酸復紅液染5 min，水洗，用95%乙醇脫色，從紅色至液體為無色，堿性美蘭液染1 min，水洗，吸水紙吸干玻片上多余的水分，鏡檢。（3）石炭酸復紅加溫染色不加碘液：11～15號玻片菌膜上加石炭酸復紅液加溫染，微微冒熱氣，需不斷補充染液，否則載玻片會變干，染5 min，待玻片冷卻后方能水洗，否則載玻片會破碎或炸裂，用95%乙醇脫色，從紅色至液體為無色，堿性美蘭液染1 min，水洗，吸水紙吸干玻片上多余的水分，鏡檢。

2 結 果

2.1 石炭酸復紅染色后加碘液染色效果 1～5號玻片染色效果好，可見清晰芽孢，見圖1。

圖1 石炭酸復紅染色后加碘液染色效果

2.2 石炭酸復紅染色不加碘液染色效果 6～10號玻片染色效果不好，也能看出芽孢，但不明顯，見圖2。

2.3 石炭酸復紅加溫染色不加碘液染色效果 11～15號玻片芽孢清晰可見，見圖3。但因苯酚的揮發，環境受到污染。

圖2 石炭酸復紅染色不加碘液染色效果

圖3 石炭酸復紅加溫染色不加碘液染色效果

3 討 論

細菌芽孢是細菌處于不利生存環境下將胞質脫水濃縮，包裹細胞核，在菌體內形成的一個圓形或橢圓形小體，是細菌的休眠形式。在芽孢期間細菌并不繁殖，是細菌在不利條件下保存生命的特殊形式。當條件適應細菌繁殖時細菌芽孢又可出芽，長成典型的生長態細菌，即繁殖體形式。細菌能否形成芽孢是由細菌遺傳因素決定的，并非所有細菌均能形成芽孢，能形成芽孢的細菌多為革蘭陽性菌，如炭疽芽孢桿菌、破傷風梭菌等。

細菌芽孢形態可有差異，有的為圓形，有的為橢圓形，有的大于菌體直徑，有的小于菌體直徑，有的位于菌體中間位置，有的存在于菌體近末端甚至完全在末端，這些特征均是細菌種屬的特征性標志，因此，芽孢染色在臨床具有診斷意義。如在鏡下見到菌體末端帶有芽孢的細菌極可能是破傷風梭菌；如見到大于菌體、位于次極端的橢圓形芽孢則很可能是肉毒梭菌。因此，芽孢染色與鏡下觀察是臨床微生物學常用技術。此外，在微生物學教學中常涉及細菌芽孢染色與觀察。但由于芽孢壁很厚，染料不易進入，故芽孢不易染色。

碘液因其低毒、黏稠度低、擴散均勻、吸收快等優點在臨床得到廣泛應用。熟知的碘酊、聚維酮碘可消毒殺菌，給患者注射碘水可用于脊髓造影，口服2%碘液可進行胰腺、十二指腸、空腸CT檢查，比淡水獲得更清楚的掃描圖像；為避免內鏡引起小腸梗阻加重、穿孔改用碘水造影，診斷小腸梗阻即簡便又安全[1]；殼聚糖碘液對真菌、紅色毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣毛癬菌、白假絲酵母等均具有明顯的殺菌作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型肝炎病毒也具有較好的滅活作用[2-5]。

碘液具有助染作用，這是不容置疑的。在經典的革蘭染色中即應用了碘液助染。碘液在革蘭染色中具有重要作用[6-7]。革蘭染色中碘液染色時間為1 min時正確率最高[8]。近年來，芽孢染色方法在不斷改進，細菌特殊染色條件不斷優化[9]，芽孢染色改用紙片加熱[10]、沸水浴加熱20 min[11-12]、微波加熱20 min[13-14]等。有研究用石炭酸復紅、堿性美蘭及孔雀綠、沙黃染液不同濃度、不同加溫時間對芽孢染色效果進行了仔細觀察比較[15-16]。

不論在乙醇燈上加熱或改用沸水浴、微波爐加熱方法均沒有減少因操作中加熱帶來的染料揮發。對芽孢進行冷染，目前報道的要么耗時長，用石炭酸復紅染芽孢時采用了延時15 min，在堿性美蘭中加入了氫氧化鉀；要么濃度加大，即用10%孔雀綠染色，常規采用0.9%孔雀綠、加長浸染時間10 min[17]。

本研究建立的冷染法借鑒了革蘭染色法中采用碘液助染替代了傳統染色中采用加溫助染，取得良好效果。在石碳酸復紅初染后染料滲透入芽孢，采用碘液助染后碘與滲透入芽孢的復紅燃料形成更大顆粒的復合物，故在隨后的脫色中不易被洗脫，因而能使芽孢獲得更好的染色。冷染實驗中所使用的試劑與傳統方法完全一致，唯一不同的是在石炭酸復紅染色5 min后增加了1個步驟，即用碘液媒染1 min，碘液與革蘭染色采用的碘液完全一致，不需另配，方法簡單易行，操作時間也與傳統方法基本一樣。因取消了加熱過程，極大減少了石炭酸或孔雀綠在加熱過程中產生的刺激性氣體，保證了實驗操作人員的健康，且染色效果優于傳統熱染法，本研究采用的芽孢冷染法是一種較好的細菌芽孢染色方法，值得在學生實驗、臨床檢驗科微生物室、感控科、消毒室推廣應用。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.22.021

B

1009-5519（2016）22-3477-02

2016-07-21）

國家自然科學基金資助項目（31570173）。

△通訊作者，E-mail：zhijinchen888@163.com。