Stomatin樣蛋白2通過PI3K通路對兒童哮喘的影響

王貞　程瑋　張雯

西安市兒童醫院呼吸二科,陜西西安710003

Stomatin樣蛋白2通過PI3K通路對兒童哮喘的影響

王貞程瑋張雯

西安市兒童醫院呼吸二科,陜西西安710003

目的研究Stomatin樣蛋白2（STOML2)基因表達在兒童哮喘發病中的作用。方法選擇2013年9月～2014年3月在西安市兒童醫院（以下簡稱“我院”)呼吸科住院的14例哮喘患兒為研究對象,選擇同期在我院進行健康體檢的9例正常兒童作為對照。采用RT-qPCR和Western blot方法檢測兩組兒童外周血單個核細胞（PBMC)中STOML2和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K)mRNA和蛋白的表達水平；構建STOML2過表達載體并轉染氣道平滑肌細胞（ASMC),MTT法檢測細胞的生長,觀察STOML2過表達對PI3K表達的影響。結果與正常兒童比較,哮喘患兒PBMC中STOML2 mRNA及蛋白水平顯著降低,而PI3K水平顯著升高,差異均有統計學意義（P＜0.05)。體外實驗結果顯示,過表達STOML2會抑制氣道平滑肌細胞生長,并抑制PI3K的表達。結論STOML2在哮喘患兒中低表達,過表達STOML2抑制ASMC的生長,其可能是通過抑制PI3K活性實現的。

兒童哮喘;Stomatin樣蛋白2;磷脂酰肌醇3激酶;氣道平滑肌細胞

支氣管哮喘（簡稱“哮喘”)是兒童最常見的慢性呼吸道疾病之一。據國際兒童哮喘與變態反應研究（the International Study of Asthma and Allergies in Childhood,ISAAC)統計,全球大約已有3億例哮喘患者,其中以發展中國家居多[1]。最近的流行學調查結果顯示,我國兒童哮喘兩年現患率為2.32%,累計患病率為3.02%[2],消耗著巨大的醫療衛生資源。目前,哮喘的發病機制尚未完全清楚,經典免疫學說認為哮喘的發病機制主要與Th1/Th2功能失衡有關,但其并不能完全解釋哮喘的發病。Stomatin樣蛋白2（Stomatinlike Protein 2,STOML2)是Stomatin家族的一員,為線粒體內膜蛋白。研究表明,Stomatin在多種癌癥中均高表達,進而調控細胞的增殖和遷移[3-4]。陳繼承[5]研究發現,人工合成的糖皮質激素——地塞米松,一種治療兒童哮喘的常用藥,可上調人肺腺癌A549細胞和大鼠肺臟中Stomatin的表達,從而增強肺泡上皮細胞膜的穩定性。另一方面,T細胞STOML2的缺失會引起線粒體呼吸的改變及CD4+T細胞應答的缺失[6],而上調STOML2可促進T細胞分化,發揮免疫調節作用并抑制凋亡[7-8]。這些研究均提示STOML2表達異常可能與哮喘的發病有關。本實驗以哮喘患兒為研究對象,構建STOML2過表達載體并將其導入人氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cell,ASMC)中,研究STOML2基因表達在兒童哮喘發病中的作用及其可能的機制。

1　對象與方法

1.1對象

選取2013年9月～2014年3月在西安市兒童醫院（以下簡稱“我院”)呼吸科就診的住院患兒作為哮喘組,其中男9例,女5例,年齡5～12,平均（8.2± 3.5)歲,哮喘診斷符合中華醫學會哮喘診斷標準[9]。選擇同期在我院兒童保健科門診進行健康體檢的兒童作為對照組,其中男5例,女4例,年齡6～13,平均（8.2±3.1)歲,均無哮喘疾病家族史,1個月內無呼吸道感染及無過敏性疾病史或其他疾病史。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2實驗材料

Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。ASMC購自美國Cambrex Bioscience公司。pCDNA3.1質粒、限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4連接酶購自美國NEB公司。大腸桿菌DH5α為我院實驗室保存。兔抗人STOML2抗體和PI3Kp85抗體購自Santa Cruz公司。SYBR Premix Ex TaqⅡ和反轉錄試劑盒購自大連寶生物工程公司,MTT試劑盒購自碧云天生物技術有限公司,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3實驗方法

1.3.1標本采集及細胞培養清晨取研究對象的靜脈血5mL,肝素抗凝。常規分離外周血單個核細胞（PBMC),培養于含10%小牛血清的RPMI 1640培養液中,待用。ASMC也培養于含10%小牛血清的RPMI 1640中。

1.3.2STOML2真核表達載體的構建及分組根據人STOML2基因全長mRNA序列（序列號為:NM_012999.1)設計STOML2的引物。STOML2上游引物為:5'-GTGACTCTCGACAATGTAAC-3',下游引物為:5'-TGATCTCATAACGGAGGCAG-3'。并在上、下游引物的5'端分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ兩個限制性酶切位點。提取ASMCs的mRNA,逆轉錄合成cDNA,而后PCR擴增STOML2基因。擴增條件為:95℃預變性5 min；95℃45s,62℃45s,72℃45s,35個循環；72℃延伸5 min。EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR擴增產物及pCDNA3.1質粒并用T4連接酶連接片段。產物轉化至DH5α細胞后,抽提重組質粒并測序鑒定。將Lipofectamine 2000和pCDNA3.1-STOML2重組質粒以2.0:0.8（v/v)的比例混合并轉染ASMCs。實驗分為3組:Blank組（未做任何處理)、pCDNA3.1組（轉染pCDNA3.1空質粒)及STOML2組（轉染pCDNA3.1-STOML2重組質粒)。轉染24 h后,提取細胞蛋白,檢測STOML2的表達水平并評測轉染效率。

1.3.3RT-qPCR檢測STOML2及PI3K的mRNA水平表達Trizol試劑抽提各組細胞總RNA并用分光光度計測定RNA吸光度值（OD值),然后用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。PCR反應體系共20 μL: SYBR Premix Ex TaqⅡ混合液10 μL,cDNA模板2 μL,上下游引物各1 μL,去離子水6 μL。反應條件為: 94℃預變性5 min；然后94℃,30 s；56℃,30 s；72℃, 40 s,共35個循環；72℃,延伸5 min。根據2-ΔΔCt計算方法計算基因相對表達水平。STOML2引物參見實驗方法1.3.2。PI3K上游引物為:5'-CAAAGCCGAGAACCTATTGCGAG-3',下游引物為:5'-GTTTGACTTCGCCATCTACCAC-3'。

1.3.4Western blot檢測STOML2及PI3K的蛋白表達量RIPA裂解細胞后測定蛋白濃度,隨后將25 μg蛋白經12%SDS-PAGE分離后,電轉到硝酸纖維素膜上。而后,用PBS封閉液（含3%脫脂奶粉,0.1% Tween-20)對膜進行封閉（室溫封閉1 h)。封閉后,加入STOML2（1:800)、PI3Kp85（1:500)及β-actin（1:1000)一抗,4℃孵育過夜,隨后用辣根過氧化物酶標記的二抗（1:2000)室溫孵育2 h。用ECL發光系統檢測目的條帶,Image Pro Plus 6.0軟件對條帶進行灰度分析。

1.3.5MTT法檢測細胞生長將對數生長期細胞以5× 103個/孔接種于96孔培養板。當細胞達到80%融合時,按步驟轉染pCDNA3.1-STOML2重組質粒,并于轉染后72 h進行MTT實驗檢測。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL)后加入150 μL二甲基亞砜。然后用酶標儀測定490 nm處吸光值。

1.4統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析,計量資料數據用均數±標準差（x±s)表示,多組間數據比較采用ANOVA單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1哮喘患兒與正常兒童STOML2表達水平

為了檢測STOML2在哮喘患兒PBMC中的表達情況,本實驗分離了兩組兒童的PBMC并通過RT-qPCR和Western blot方法進行了測定。RT-qPCR結果顯示,哮喘患兒PBMC中STOML2-mRNA水平（0.41±0.05)顯著低于對照組（0.77±0.04),Western blot結果也驗證了這一現象（P＜0.05)。見圖1。

2.2STOML2過表達載體的構建

在ASMC中,與Blank組比較,轉染STOML2過表達載體可顯著提高STOML2的mRNA及蛋白表達水平,差異均有統計學意義（P＜0.05)。與pCDNA3.1組比較,STOML2組STOML2的mRNA及蛋白水平也顯著升高,差異均有統計學意義（P＜0.05)。說明STOML2過表達載體構建成功。見表1、圖2。

圖1　哮喘患兒與正常兒童PBMC中STOML2的表達水平

表1　各組STOML2 mRNA及蛋白表達水平比較（±s,n=4)

表1　各組STOML2 mRNA及蛋白表達水平比較（±s,n=4)

注:與Blank組比較,*P＜0.05；與pCDNA3.1組比較,#P＜0.05

組別mRNA表達蛋白表達Blank組1.00±0.051.00±0.02 pCDNA3.1組1.00±0.091.03±0.07 STOML2組3.19±0.24*#2.19±0.16*#

2.3過表達STOML2抑制ASMC細胞增殖

為了探討STOML2影響哮喘的機制,在體外測定了過表達STOML2對ASMC細胞增殖的影響。MTT實驗結果顯示,與Blank組[（95.00±1.45)%]和pCDNA3.1組[（95.17±2.69)%]比較,STOML2組[（50.13± 3.11)%]細胞增殖能力顯著降低,差異均有統計學意義（P＜0.05)。見圖3。

2.4PI3K表達水平

為了進一步探討STOML2調控哮喘的機制,本實驗從體內外水平檢測了PI3K的表達。體內實驗顯示,與對照組[mRNA水平:（0.33±0.02)；蛋白水平:（0.43±0.03)]比較,哮喘患兒PBMC中PI3K水平[mRNA水平:（0.72±0.04)；蛋白水平:（1.03±0.12)]顯著升高（P＜0.05),見圖4A。細胞實驗顯示,與Blank組[mRNA水平:（1.00±0.05)；蛋白水平:（1.00±0.07)]比較,STOML2組PI3K水平[mRNA水平:（0.54±0.06)；蛋白水平:（0.48±0.09)]顯著降低,差異均有統計學意義（P＜0.05),提示過表達STOML2可顯著降低PI3K的水平與PI3K水平呈負相關,見圖4B。

圖2　STOML2過表達載體的效果

3　討論

STOML2屬于Stomatin樣蛋白家族,是細胞呼吸鏈復合物正確發展的必須基因[10],調控細胞增殖、黏著等多種功能[11]。STOML2位于染色體9p13.1上,其在多種癌癥中發揮著生物學功能。Zhang等[11]發現喘患兒外周血PBMC中低表達,提示STOML2在哮喘發病中扮演一定的角色。

氣道炎癥和氣道重構（如氣道平滑肌層的增生和肥大及基底的增厚)是支氣管哮喘的重要病理表現[14]。然而現在關于氣道重構的機制尚不明確,哮喘時ASMC增生是氣道重構的主要原因[3]。Johnson等[4]通過體外培養哮喘患者ASMC發現,與非哮喘患者比較,哮喘患者ASMC的增殖能力明顯升高。本實驗進一步構建了STOML2過表達載體并檢測了其對ASMC增殖的影響。實驗結果表明過表達STOML2可以抑制ASMC細胞增殖。這與Revez等[15]人的發現一致,即STOML2是一個潛在的哮喘風險基因。

越來越多的研究表明,PI3K信號通路在哮喘的病理生理過程中起著重要作用[16],且對ASMC增殖起著正向調節的作用。Scott等[17]報道指出,在牛ASMC中,活化PI3K會增強DNA的有絲分裂,而PI3K抑制劑wortmannin可顯著減少DNA合成。另一方面,研究也發現抑制調節性體細胞（regulatory T cells,Treg)中PI3K信號通路的活化有助于維持Treg細胞種群的體內平衡和免疫功能[18]。而PI3K信號可以通過參與Th1/Th2、Treg/Th17的失衡參與哮喘的發病過程[19-20]。 STOML2在人食管鱗狀細胞癌、肺癌、喉癌及子宮內膜癌組織中均高表達,在人食管鱗狀細胞癌細胞系KYSE450中,沉默STOML2伴隨著細胞生長、增殖和細胞黏著的抑制。STOML2在上皮性卵巢癌及胃腺癌細胞中高表達,且與患者的不良預后有顯著相關性[12-13]。之前研究表明,地塞米松作為一種可治療哮喘的糖皮質激素,可引起大鼠肺臟Stomatin的上調[5], STOML2缺失也會引起T細胞應答的缺失[6-7],提示STOML2可能與哮喘有關。本研究發現STOML2在哮本研究發現,STOML2負調節PI3K信號通路,即在哮喘患兒PBMC中,STOML2的低表達伴隨著PI3K的升高,而在ASMC中,過表達STOML2可以顯著降低PI3K的水平,這為哮喘的治療提供了一個潛在的基因靶點。

圖3　過表達STOML2對細胞增殖的影響

A:哮喘患兒和正常兒童PI3K mRNA及蛋白表達水平；B:ASMC中各組PI3K mRNA及蛋白表達水平；與對照組/Blank組比較,*P＜0.05；與pCDNA3.1組比較,*#P＜0.05

綜上所述,本研究表明STOML2在哮喘患兒外周血PBMC中低表達,并且過表達STOML2可以抑制ASMC細胞凋亡,而此過程可能與PI3K信號通路有關。因此,STOML2有望成為治療哮喘的靶標分子。

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Effect of STOML2 on childhood asthma through PI3K pathway

WANG ZhenCHENG WeiZHANG Wen
The Second Department of Respiration,Xi'an Children's Hospital,Shaanxi Province,Xi'an710003,China

Objective To investigate the effect of Stomatin-like Protein 2(STOML2)expression on pathogenesis of childhood asthma.Methods Totally 14 children with asthma who were hospitalized in the Department of Respiration, Xi'an Children's Hospital(“our hospital”for short)were recruited from September 2013 to March 2014,and 9 healthy children who

physical check-ups in our hospital at the same period were taken as controls.The mRNA and protein levels of STOML2 and phosphatidylinositol 3 kinase(PI3K)in peripheral blood mononuclear cell(PBMC)of children in two groups were detected by RT-qPCR and Western blot.In addition,STOML2 over-expressed vector was synthesized and transfected to airway smooth muscle cells(ASMC).The cell viability was detected by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)assay,and the effect of STOML2 over-expression on the level of PI3K was observed.Results The mRNA and protein levels of STOML2 in PBMC of asthmatic children were significantly decreased when compared with those in normal children,while the PI3K level was markedly increased,the differences were statistically significant(P＜0.05).In vitro assay showed that over-expression of STOML2 inhibited the growth of ASMC and the expression of PI3K.Conclusion STOML2 is decreased in asthmatic children and over-expression of STOML2 inhibited the growth of ASMC,which is accompanied by inhibiting PI3K pathway.

Childhood asthma;Stomatin-like Protein 2;PI3K;Airway smooth muscle cell

R562.2

A

1673-7210(2016)06(b)-0020-05

（2016-03-05本文編輯:任念)