山苓祛斑凝膠劑提取物質量標準研究

陳 軍 舒 祥 余南才

武漢市中西醫結合醫院藥學部，湖北 武漢 430022

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藥物研究

山苓祛斑凝膠劑提取物質量標準研究

陳 軍 舒 祥 余南才

武漢市中西醫結合醫院藥學部，湖北 武漢 430022

目的：建立山苓祛斑凝膠的質量標準。方法：運用HPLC法測定祛斑凝膠提取物中尿囊素、阿魏酸含量作為評價指標，流動相分別為乙腈-0.085%磷酸-水(5∶95)、(17∶83)，流速為0.5mL/min、1mL/min，柱溫30℃，檢測波長為224nm、316nm。結果：尿囊素、阿魏酸線性范圍0.368～2.208μg、0.424～2.544μg，精密度RSD0.55%、0.92%，穩定性RSD1.4%、1.5%，重復性RSD0.95%、0.55%。祛斑凝膠劑中尿囊素、阿魏酸含量分別為11.2mg/g、4.5mg/g。結論：該方法重復性好，質量可控，可為該凝膠制劑進行中試、生產提供參考。

山苓祛斑凝膠；含量測定；高效液相色譜法

黃褐斑也稱“肝斑”、“蝴蝶斑”，為面部黃褐色色素沉著，且多對稱蝶形分布于頰部，大小不一、形態不定，好發于育齡期女性[1]。黃褐斑由多種因素綜合作用導致，其發病與妊娠、長期口服避孕藥、月經紊亂有關，血中雌激素水平高是主要原因。目前，尚無徹底治愈方法，臨床治療方法有一定的副作用，如造成外源性褐黃病、皮膚萎縮、永久性脫色，甚至出現腎毒性、精神、神經癥狀等，因而黃褐斑一直是醫學界關注的問題。中醫藥治療黃褐斑有著悠久歷史，具有一定優勢。中藥凝膠劑是一種新型外用制劑，適用于皮膚、黏膜及腔道，不僅避免口服給藥存在的胃腸道內酶、酸等首過作用，而且可減輕藥物不良反應，同時具有使用方便、舒適、生物相容性好等多種優點，臨床上治療黃褐斑已取得較好療效[2-4]。復方中藥山苓祛斑方為我院中醫部周利副主任醫師經驗方，由山藥、茯苓、白芷、白及、當歸等藥組成。研究以尿囊素、阿魏酸含量作為凝膠劑質量標準[5-6]，用HPLC法測定凝膠劑中尿囊素、阿魏酸含量，為其質量控制提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色譜儀(紫外DAD檢測器，美國DIONEX公司)；CP 2104 電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。

1.2 材料 山藥、茯苓、當歸等9味中藥材飲片(亳州國一堂中藥飲片有限公司)，祛斑凝膠劑(批號：20150401、20150405、20150410，自制)；凝膠劑陰性樣品(自制不含當歸及山藥的樣品各一份，批號20150410)，尿囊素(批號：111501-200001)、阿魏酸對照品(批號：110773-200611)、茯苓(批號：121117-201302)、當歸(批號：120927-201408)、山藥(批號：121137-201405)等對照藥材購于中檢所，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 祛斑凝膠提取物中尿囊素含量測定

2.1.1 色譜條件 ODS C18色譜柱(Thermo-Scientific Syncronis, 250mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-0.085%磷酸水(5∶95)；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：224nm；進樣量：10μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取尿囊素對照品9.2mg，置50mL量瓶中，用超純水稀釋至刻度。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取山苓祛斑凝膠提取物3g，加入適量甲醇超聲溶解，加入100-200目硅膠4.5g，蒸干溶劑后進行硅膠柱色譜分離。硅膠用量為50g (300～400目)，洗脫劑選擇二氯甲烷∶甲醇(9∶1)，收集200mL，濃縮后用甲醇稀釋至10mL，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對照溶液制備 按處方量制備除山藥外的所有組分的凝膠劑，作為山藥陰性對照樣品，余同“2.1.3”操作，即得。

2.1.5 線性關系考察 分別進樣2、4、6、8、10、12μL以尿囊素含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程y=9.0814x+0.0354，R2=0.9998，表明尿囊素在0.368～2.208μg線性關系良好。2.1.6 精密度試驗 精密吸取供試品溶液10μL，連續進樣6次，記錄峰面積積分值，結果表明：精密度良好，平均峰面積為15.5925，RSD為0.55%。

2.1.7 穩定性試驗 精密吸取尿囊素標準品溶液10μL，按0、4h、8h、12h、16h、24h 進樣1次，記錄峰面積積分值，結果表明：尿囊素標準品穩定性良好，RSD為1.4%。

2.1.8 重復性試驗 取同一批凝膠劑6份，按尿囊素供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件進樣6次，計算尿囊素平均含量為4.5mg/g，RSD為0.95%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 稱取山苓祛斑凝膠提取物1.5g，分別加入尿囊素對照品溶液15μL，按照供試品溶液制備的方法處理，進樣10μL，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計算尿囊素標準品的加樣回收率為97.2%，RSD為1.2%。

2.1.10 尿囊素含量測定 精密吸取供試品溶液10μL，液相色譜儀，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計算得出尿囊素含量為4.5mg/g。

2.2 山苓祛斑凝膠提取物中阿魏酸含量測定

2.2.1 色譜條件 ODS C18色譜柱(Thermo-Scientific Syncronis, 250mm×4.6 mm，5μm)；流動相：乙腈-水(17:83)；流速：1mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：316nm，進樣量：10μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品，加甲醇制備成濃度為0.212μg/μL的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取山苓祛斑凝膠提取物10g，加甲醇超聲，并定容至50mL容量瓶中。

2.2.4 陰性對照溶液制備 按處方量制備除當歸外的所有組分的凝膠劑，作為當歸陰性對照樣品，余同“2.2.3”操作，即得。

2.2.5 線性范圍考察 分別精密吸取阿魏酸對照品溶液2、4、6、8、10、12μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積和進樣量求得回歸方程y=1.2937x+0.3404,R2=0. 9996，表明在0.424～2.544μg有良好線性關系。

2.2.6 精密度實驗 精密吸取對照品溶液10μL，重復進樣6次，測得峰面積，其RSD為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 精密吸取阿魏酸標準品溶液10μL，按0、4、8、12、16、24h 進樣1次，記錄峰面積積分值，結果表明：阿魏酸標準品穩定性良好，RSD為1.5%。

2.2.8 重復性試驗 取同一批凝膠劑6份，按阿魏酸供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件進樣6次，計算阿魏酸平均含量為11.4mg/g，RSD為0.55%，表明該方法重復性良好。2.2.9 加樣回收率實驗 精密量取兩份1mL樣品溶液：向其中一份精密添加阿魏酸對照品溶液，定容至50mL，測得平均回收率為96.8%，RSD為1.56%。

2.2.10 阿魏酸含量測定 精密吸取供試品溶液10μL，液相色譜儀，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計算得出阿魏酸含量為11.2mg/g。2.3 山苓祛斑凝膠劑TLC定性鑒別 按2015版《中國藥典》一部及附錄(0502)薄層色譜法對祛斑凝膠劑中山藥、當歸及茯苓進行TLC定性鑒別[7]，供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。

按文獻[8]對山苓祛斑凝膠劑中的尿囊素進行薄層鑒定：取山苓祛斑凝膠劑10g，加入適量甲醇超聲溶解，溶解后吸取10μL點于硅膠GF254板，以氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶甲醇(1∶8∶1∶1∶2)為展開劑，15%的對二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液為顯色劑。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同黃綠色斑點，且陰性樣品無干擾。

3 討論

3.1 波長選擇 經紫外光譜掃描，測得尿囊素在224nm處有最大吸收，阿魏酸在316nm處有最大吸收，故本文分別選擇224nm作為尿囊素的檢測波長，316nm作為阿魏酸的檢測波長。

3.2 流動相的選擇 原有用甲醇-水(1∶9)測定尿囊素含量，實驗發現其分離效果不好，分離度不能達到分析要求；甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(2∶98)比例的極性太大，而純水對色譜柱的損害較大。經摸索最后采用乙腈-0.085%磷酸-水(5∶95) 作為流動相，基本能夠達到較好的分離效果，尿囊素出峰時間大約在5.5min左右。重復性試驗RSD為0.95%，加樣回收試驗測得平均回收率為96.8%，RSD為1.56%也表明在此色譜條件下尿囊素的分離效果較為滿意。

研究通過測定山苓凝膠劑中尿囊素和阿魏酸的含量，初步確定了山苓凝膠劑的質量控制方法。所建立的方法簡單，準確，分離度與重現性均好，可以用于控制山苓凝膠劑的質量。

[1]康金森，王雪飛，劉發，等．紅玉祛斑膠囊對黃褐斑模型小鼠的影響[J].中藥藥理與臨床，2013,29(4):134-136．

[2]劉林，霍志斐，史樹堂，等．茯苓多糖的藥理作用概述[J].河北中醫，2010,32(9):1427-1428．

[3]楊宏莉，李少春，張偉偉，等．山藥多糖的藥理作用[J].醫學研究與教育，2010,27(3):80-82．

[4]樊靚，湯尚文，余海忠，等．山藥中尿囊素研究進展[J].食品科學，2015,(3):308-308．

[5]王海波，蔡寶昌．反相高效液相色譜法測定不同產地山藥中尿囊素的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2004,15(3):190-192．

[6]胡杰,馮麗莉,崔福德．當歸川芎中阿魏酸提取的研究[J].時珍國醫國藥，2004,15(11):732-733．

[7]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[S]．北京：中國醫藥科技出版社，2015：57-58．

[8]凌育趙．淮山米粉中尿囊素的檢測及提取工藝研究[J]．糧油食品科技，2005,13(3):45-51．

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(編輯：陶希睿)

Quality Standards Control of the Shanling Quban Gels

CHEN Jun SHU Xiang YU Nancai

Integrative Medicine Hospital of Wuhan City Department of Pharmacy，Wuhan 430022,China

Objective Study on establish quality standards of Shanling Quban gels. Methods The content of allantoin and ferulic acid was used as the index to optimize the extraction process by HPLC analysis. Results Allantoin and ferulic acid showed a good linear relationship in the range of 0.368～2.208μg, 0.424～2.544μg with an average recovery ofRSD1.4%, 1.5%，RepeatabilityRSD0.95%, 0.55%. and precision ofRSD0.55%, 0.92%, respectively．Average extracting amount of allantoin and ferulic acid in the Shanling Quban gels was 11.2mg/g and 4.5mg/g．Conclusion This method is simple and appropriate for quality control of Quban gels and provide a reference for industrial production of this preparation．

Shanling Quban gels；Content determination；HPLC

2016-08-17

陳軍(1975-)，男，漢族，碩士研究生，主管中藥師，研究方向為中藥鑒定、中藥藥物分析、中藥炮制。E-mail:10078474@qq.com

R284.1

A

1007-8517(2016)21-0011-03