食品中丙烯酰胺檢測新技術研究進展

王紫夢 魯 迨 石星波,2,3 鄧潔紅

(1.湖南農業大學食品科學與技術學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南農業大學東方科技學院，湖南 長沙 410128；3. 湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，湖南 長沙 410082)

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食品中丙烯酰胺檢測新技術研究進展

王紫夢1魯 迨1石星波1,2,3鄧潔紅1

(1.湖南農業大學食品科學與技術學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南農業大學東方科技學院，湖南 長沙 410128；3. 湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，湖南 長沙 410082)

丙烯酰胺(AA)是一種食品熱處理加工過程中產生的具有神經毒性與潛在致癌性的物質，已引起全世界范圍的廣泛關注。準確測定復雜食品體系中AA的含量，是評估其對人體危害的前提。文章評述了AA傳統檢測方法(液相色譜，氣相色譜，液質聯用和氣質聯用)的不足，主要體現在樣品前處理過程復雜、需要必要的衍生化、分析儀器昂貴及需要專業技術人員操作等方面；并重點介紹了毛細管電泳法、酶聯免疫吸附試驗法、超分子識別法、納米生物傳感法等新型的檢測方法的優缺點，及在實際應用中遇到的具體問題；同時，對未來檢測方法的發展方向進行展望，旨在為更高效、實用檢測方法的開發提供思路。

丙烯酰胺；檢測；毛細管電泳法；酶聯免疫吸附試驗法；超分子識別法；納米生物傳感器

丙烯酰胺(acrylamide，AA)于1994年被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)劃分為“可能致癌物”[1]。2002年4月，瑞典國家食品機構和斯德哥爾摩大學的研究人員發現在油炸及焙烤的淀粉類熱加工食品中存在大量的AA[2-3]，這一發現引起了全世界的關注。食品的熱處理是現代食品加工過程中不可或缺的工序，富含碳水化合物的食物在熱處理下發生美拉德反應，從而使其擁有特定的色、香、味。因此，加強食品中AA的濃度監測就顯得尤為重要[4-6]。

準確定量分析食品中的AA，是準確評估這種化合物危害的前提。近年來，由于增加了AA對人類生物體誘變、致癌的影響以及其機制的了解[7-8]，開發新AA檢測方法的目的不僅在于對痕量AA生物標志物的監測，還在于對其相關風險水平的判斷[9]。目前，更多的研究[10-11]主要集中在改進現有的技術方法。而AA因其低分子量(71.08)、高極性、較好的水溶性(215.5 g/100 mL)、高反應活性以及復雜的食品基質，增加了定量食品中AA的難度[12]。因此，開發高靈敏、高選擇性、能對抗富含干擾化合物和復雜基質樣品的新型檢測方法，具有一定的緊迫性與挑戰性。

目前，AA的常用檢測方法有氣相色譜法(gas chromatography，GC)或氣相—質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry，GC—MS)，液相色譜法(liquid chromatography，LC)或液相—質譜聯用( liquid chromatography-mass spectrometry，LC—MS)等傳統方法[13]。近年來，還發展了一些新型的檢測方法，如毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)法、酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法、納米生物傳感法等[14]。為進一步提高檢測的靈敏度、減少樣品的前處理過程、使分析的數據更為可靠，更有效評估AA對人體的危害，文章綜述比較AA檢測方法的優缺點及在實際生產中的應用，旨在為開發優良檢測策略提供新思路。

1 傳統檢測方法存在的不足

1.1 液相色譜及液質聯用

使用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)定量分析食品中的AA，需進行純化處理以去除食品中的蛋白質及脂肪，防止干擾測定結果。紫外(ultraviolet，UV)與質譜(mass spectrometry，MS)是液相色譜中常見的兩種檢測器。因為AA缺乏足夠強的生色基團(芳香環，共軛雙鍵或三鍵)和自然熒光，必須使用短波長(195～205 nm)紫外線來測定，導致了LC—UV對AA的檢測響應并不靈敏，且選擇性欠佳。通常LC—UV僅被用來確定食品中是否含有高含量的AA，而對于低含量AA的測定靈敏度不高。因此，監測低含量的AA往往需要使用LC—MS/MS技術，質譜檢測器具有高靈敏度和高選擇性，避免了衍生化的步驟[14-16]，但分析成本較高。

1.2 氣相色譜及氣質聯用

因AA并不具有低揮發性，利用氣相色譜檢測時，首先需要對AA進行必要的衍生化，以提高其檢測靈敏度[17]。經典的方法是利用溴水衍生AA，讓其轉變成2，3-二溴丙烯酰胺，然后分析衍生物的譜圖性質，可以得到較好的靈敏度[18]。廖燕芝等[19]對采用外標法、標準加入法、同系物甲基丙烯酰胺作內標的標準曲線法這3種定量方法測定食品中AA進行比較，發現以同系物甲基丙烯酰胺為內標，采用標準曲線法測定，定量的結果較準確。GC—MS分析中主要特征定性的離子碎片(m/z)有：152，150，108，106，并且具有一定的相對豐度比。除此之外，根據需要還可選擇電子捕獲檢測器、高分辨率時間飛行質譜、串聯質譜、氮磷檢測器及火焰離子化檢測器等[20-23]。

2 新型檢測方法

2.1 毛細管電泳法(CE)

CE是檢測食品中AA的一種相對較新且發展迅速的分析方法，能實現混合物的快速分離，且能同時分離極性和非極性化合物。其原理是在一根石英毛細管(長約50～100 cm，內徑約50 μm)中充滿緩沖溶液，當在毛細管兩端施加高電壓時，溶解在電解質中的帶電化合物會以不同的速率遷移，從而實現混合物的分離。由此可見，被分離物帶電是電泳分離的前提。然而，AA是一種不帶電荷的化合物，要實現在電場條件下的高效分離，必須使其帶上電荷。不少的課題組為此展開了研究，具有代表性的有3種改進型的電泳方法。

(1) 毛細管膠束電動色譜法(micellar electrokinetic chromatography，MEKC)：該法主要是在緩沖液中加入離子型的表面活性劑，AA被表面活性劑包裹，形成帶電的膠束，通過檢測AA膠束實現AA的定量檢測。Zhou等[24]據此思路實現了食品中AA的檢測。

(2) 毛細管區帶電泳法(capillary zone electrophoresis，CZE)：該法通過柱前衍生使AA帶電，以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離。為了提高檢測的靈敏度，Bermudo等[25]利用場放大進樣系統，以CZE配備紫外檢測器實現了餅干、面包、麥片、薯片和咖啡中AA的高靈敏檢測，其檢測下限達到了3 ng/g。為進一步提高檢測的選擇性與靈敏度，可配備MS檢測器[26]，或使用離子阱分析器、飛行時間分析器、三重四極桿分析器[27]等先進的檢測器，但會大大增加分析成本。

(3) 非水毛細管電泳(non-aqueous capillary electrophoresis，NACE)：該法是一種能實現AA檢測的CE方法[28]。AA在水相中是極性且不帶電荷的化合物，不能在電場移動，而在低pH值的非水有機相中能質子化，比如乙腈，可使其帶電，進而能在電場的作用下移動。這種NACE已實現了油炸土豆片中AA的高靈敏檢測，其檢測下限達到了4.4 ng/mL[29]，要比CZE的檢測靈敏度更高[30]。

電泳技術作為一種檢測食品中AA的有效分析方法，主要是其具有進樣量小，分析快速，設備相對簡單，同時能實現高靈敏檢測等優點。與高效液相色譜技術比較，電泳技術的優勢在于不需要復雜的樣品前處理過程。

2.2 酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)

ELISA是一種基于抗原與抗體的高特異反應連接酶，通過檢測酶催化底物產生顏色反應，從而實現快速定量的方法。AA屬小分子半抗原，缺乏強的表位組，無免疫原性[31]。因此，完全抗原的獲得必須首先與大分子的免疫載體蛋白連接，然后，通過刺激復雜的完全抗原發生免疫反應生成抗體。到目前為止，有3種較為普遍的方法。

(1) 最常見的方法是使用活性酯結合AA和蛋白質，如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)。研究[32-33]表明，“AA-親和基團”和載體蛋白之間的交聯長度是獲得高效價抗體的關鍵。王宵雪等[33]利用AA與兩種AA的模擬分子(丙烯酰胺基丁酸與丙烯酰胺基苯甲酸)制備了3種AA人工抗原，并進行了動物的免疫試驗，進而得到了高效價的抗體；其中，由丙烯酰胺基苯甲酸人工抗原獲得的抗體表現出最高效價。與此同時，該抗體也表現出很高的特異性，經測定針對1 μg/mL衍生產物的抑制率達到了80.7%，而針對AA及對巰基苯甲酸均無交叉反應。該研究為建立快速檢測食品中AA的ELISA方法奠定了較好的基礎。Wu等[34]也進一步驗證了上述觀點。原因可能是當偶聯點遠離待測物的特征結構部分和官能團時，載體蛋白對小分子結構的屏蔽作用最小[35]。但是這種方法需要衍生化AA，增加了分析的時間。

(2) 直接利用戊二醛進行共軛。以兩個醛基為活性基團，通過形成席夫堿來連接蛋白氨基和AA[36]。付云潔等[37]利用這種方法結合AA和牛血清白蛋白來合成人工抗原。該法簡單方便，但可能會導致低效，甚至造成抗原表位的進一步損耗。

(3) 用N-丙烯酸琥珀酰亞胺酯(N-acrylic succinimide ester，NAS)作為半抗原[38-39]。NAS包含AA和NHS的結構，這有利于NAS與氨基反應且直接與AA在載體蛋白上進行共軛。Zhou等[38]用這種方法來合成具有高抗體—抗原結合常數(Kaff = 6.7×107L/mol)的完全抗原。此方法對試劑或活化沒有要求，能顯示出高耦合效率，且能保持共軛中AA的完整結構。

總體來講，相比傳統的檢測方法，ELISA法盡管在檢測的靈敏度上沒有優勢，但是，該法分析速度快，花費少，且不需要昂貴的儀器與復雜的樣品前處理過程。開發ELISA試劑盒有不錯的市場前景。Frank等[40]開發的ELISA試劑盒的檢測下限為5 g/kg，線性范圍為10～10 000 g/kg，具有較高的回收率，完全能滿足市場需求。然而，如何獲得高特異性與親合力的抗體依然是未來需要努力的方向。

2.3 超分子識別法

“主”超分子和“客”分子之間的高度選擇性和穩定性是由于分子間的相互作用和大環效果。基于超分子化學性的分子印跡技術(molecular imprinting technique，MIT)已在液相色譜、固相萃取和傳感食品分析領域中得到應用[42]，并被認為是“化學抗體”。如權英等[43]以AA的結構類似物丙酰胺為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，采用本體聚合法制備出了對AA具有較好選擇性的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)。MIT是制備對特定目標分子具有特異性識別能力的高分子材料的技術，所制備的MIP具有構效預定性、特異識別性和廣泛實用性三大特點。因此，在食品樣品的前處理和識別應用方面，MIT將有望解決許多棘手的樣品前處理問題。

2.4 納米生物傳感法

納米生物傳感法是一種較有前景的食品中AA的定量檢測方法。與其他方法相比，具有價格較低、抗復雜基質的干擾能力強、選擇性強、靈敏度高等[44]諸多優點。基于此，生物傳感器已被廣泛用于病原微生物及其毒素的檢測，以及監測農藥、過敏原和抗生素的水平[44]。生物傳感器是一組可以將具有解析活性的生物部分(生化受體)連接到各種處理器的傳感器[45]。按照響應原理的不同，可以把生物傳感器分為多種類型。在眾多種類的生物傳感器中，電化學生物傳感方法與熒光傳感方法是檢測AA最常見的方法。

2.4.1 電化學生物傳感方法 電化學生物傳感方法是一種常見的用來定量分析食品中AA的新型生物分析技術。該方法主要是通過使用高選擇性的生物受體來實現被分析物的定量檢測。這種傳感器的生物組分可以是酶、酶蛋白、抗體、天然受體、整個微生物、組織片段、單細胞、DNA和RNA。處理器將生物反應轉換成生物性的或生化信號，或可以被進一步放大并變為可測量的分析電信號。監測電流與電壓的變化是最常見的兩種類型，比較有代表性的有循環伏安分析法(cyclic voltammetry，CV)和方波伏安分析法(square wave voltammetrya according to Osteryoung，OSWV)。

血紅蛋白(hemoglobin，Hb)可以作為AA的受體，這是因為AA可以與位于Hb多肽鏈N-末端的纈氨酸a-NH2基團之間發生邁克爾加成反應，形成Hb-AA復合物，具有較高的親合力。在醋酸鹽緩沖液中表面活性劑二甲基雙二十八烷基溴化銨(dimethyldioctadecylammonium bromide，DDAB)與Hb形成脂質體DDAB-Hb，將Hb固定于涂層了DDAB-Hb的碳糊電極上，AA的加入誘導Hb的結構發生了變化，從而改變電極的活性，進而產生響應信號，實現AA的高靈敏檢測(1.2×10-10mol/L)[46]。血紅素作為Hb的輔基，電極表面上的Hb-AA復合物濃度增加時，使得血紅素中發生Fe(Ⅲ)離子還原成Fe(Ⅱ)離子的不可逆反應。伏安分析法測定結果提供了有關電化學反應定量和定性的信息，及關于測試樣品中的AA含量的準確信息[47]。

在信號處理器表面上固定生物成分需要確保該生物材料的穩定性，這是構建生物傳感器的關鍵問題。生物分子如Hb吸附在電極的表面上經常會導致其變性和失活。許多研究人員[47-49]進行了優化固定化的方法，旨在提高檢測的穩定性。能維持電化學反應電子轉移的碳納米管與膠體金是充當生物元件的穩定劑的較好選擇[48]。Krajewska等[47]使用的伏安電化學生物傳感器含有固定化的Hb和修飾了單壁碳納米管的玻碳電極(glassy carbon electrodes，GCE)，用于食品提取液中AA的檢測，結果表明，電極的敏感性不受從薯片中提取的基質組分的影響；在該條件下，OSWV要比CV的靈敏度更高，其檢測限低至1.0×10-9mol/L。Garabagiu等[49]先在玻璃電極表面上沉積金納米顆粒和銦錫氧化物，然后修飾Hb，利用AA和Hb之間的相互作用，也實現AA的高靈敏檢測(檢測限低至10-8mol/L)。

紫外可見光譜已證實了AA與DNA能相互作用。根據這種相互作用，Li等[50]提出一種用于電化學測定AA的無標記DNA傳感器。先用氧化石墨烯(graphene oxide，GO)涂覆在GCE表面上，然后將DNA吸附固定在GO/GCE上，形成DNA/GO/GCE傳感器。由于GO的表面積較大，DNA能有效地固定在電極表面上。此外，GO獨特的納米結構和優異的電子傳遞能力顯著促進了DNA電子的直接轉移。在GO/GCE上DNA顯示了兩個可用作響應AA電化學信號的強氧化峰。結果表明，該傳感器有良好的再現性和高穩定性。

Wang等[51]在MIP膜的基礎上構建了新型檢測AA的電化學傳感器。金納米顆粒通過Au-S鍵和氫鍵的相互作用對GCE進行修飾，然后對氨基苯硫酚和AA在金納米顆粒的表面上進行修飾，聚合物膜由含有對氨基苯硫酚、氯金酸、四丁基高氯酸銨和一個虛擬模板分子丙酰胺的聚合物溶液電聚合而成。在移除AA后獲得了一種新型的分子印跡傳感器，其檢測限為0.5×10-12mol/L，線性響應范圍為1×10-12～1×10-7mol/L。該研究提供了一種快速，靈敏和實時地檢測樣品中AA的方法，且無需復雜的預處理。

電化學生物傳感檢測AA不需要復雜的樣品前處理，主要得益于電化學信號能抵抗基質成分引起的干擾，使得該法的操作十分簡便，有望替代傳統的液相色譜、氣相色譜法。

2.4.2 熒光傳感方法 熒光傳感方法用于檢測生物分子、離子等得到了廣泛應用。但是用于檢測AA的報道并不多見。最近，Hu等[52]提出了一種基于AA聚合量子點(quantum dots，QDs)獨特光物理性質的新型熒光傳感檢測AA方法。該研究中，在QDs表面修飾NAS后，經紫外線的誘導，NAS上的碳—碳雙鍵發生聚合，導致QDs之間的距離減小，進而導致QDs的熒光強度發生變化。在AA的存在下，由于AA會參與聚合反應，使QDs之間的距離增大，從而增加了熒光強度。因此，根據AA的濃度與熒光強度變化的相關性可建立用于檢測AA的方法。其線性范圍和檢測限分別為35～350 000 μg/kg和35 μg/kg。與傳統方法和電化學生物傳感方法相比，因其靈敏度并不高，應用將受到限制。

Liu等[53]研究了另一種檢測食品中AA的熒光方法。AA通過霍夫曼反應降解生成乙烯胺，該物質能與熒光胺反應生成吡咯烷酮，從而致使其在480 nm下有強熒光發射。熒光強度隨著AA的增加而增加，且具有良好的相關性系數(r2=0.99)。這種方法表現出與傳統方法相類似的靈敏度與重現性。然而高溫反應條件限制了本方法用于在線檢測食品中的AA。

熒光傳感方法具有操作方便以及不需要大型儀器等優點。然而，與傳統方法和電化學生物傳感方法相比，基于化學反應的熒光傳感方法有靈敏度低和選擇性欠佳的缺點，還需要進一步研究。未來開發熒光傳感檢測AA的方法，需要考慮以下兩個問題：① 如何有效利用AA分子中的官能團(比如，碳碳雙鍵)，結合納米熒光顆粒的光學性質，設計出高靈敏的檢測策略，以提高其檢測的靈敏度；② 如何克服食品中共存物質對選擇性的影響。

3 結論

綜上所述，已有的食品AA檢測方法均各具優缺點。不同的食品基質需要不同的樣品前處理方法，也就說明沒有一個固定可行的方法能適應所有類型的產品。通過不同酶聯免疫吸附試驗法獲得具有高親合力、高特異性的AA相關抗體，可以為開發高選擇性的，且省略復雜樣品前處理的生物傳感方法奠定良好的基礎。納米材料在電學和光學方面的優良特性為開發高靈敏度、高通量、重現性良好的納米傳感方法提供了思路。未來檢測AA的方法將朝著簡化樣品前處理，快速、低價、現場即時檢測等方向發展。

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New determination methods of acrylamide in food products

WANGZi-meng1LUDai1SHIXing-bo1,2,3DENGJie-hong1

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China;2.OrientScience&TechnologyCollege,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China;3.StateKeyLaboratoryofChemo/BiosensingandChemometrics,HunanUniversity,Changsha,Hunan410082,China)

Acrylamide (AA) is a kind of neurotoxin and potential carcinogen, formed in heating food treatment, has been aroused extensive attention in all over the word. Accurate determination of AA in complex food system is the first importance to evaluate its harmful effects on human health. In this paper, the disadvantages of traditional determination methods of AA, including liquid chromatography, gas chromotography and their coupling technique, were reviewed. Moreover, the complex of sample pretreatment process, requirement of necessary sample derivatives and professional analyzer, and expensive analytical instruments etc. were focused on. Furthermore, several new determination methods, such as capillary electrophoresis, enzyme-linked immunosorbent assay method, super-molecular recognition method, and nano-biosensor, etc. were introduced in detail. The advantages, disadvantages and the existing problems of the current determination methods in practical application were also indicated. Summarizing these methods were helpful to provide thoughts to develop more practical methods. In the future, the promising determination methods should satisfy many merits, including simple sample preparation, rapid and time-saving, low-costing, point-of-care testing and so on.

acrylamide; determination; capillary electrophoresis; enzyme-linked immunosorbent assay; super-molecular recognition method ; nano-biosensor

國家自然科學青年基金(編號：31301484)；湖南省自然科學青年基金(編號：2015JJ3082)；湖南農業大學青年項目(編號：14QN11，14QNZ14)；化學生物傳感與計量學國家重點實驗室(湖南大學)開放項目(編號：Z2015025)

王紫夢，女，湖南農業大學在讀碩士研究生。

石星波(1984—)，男，湖南農業大學副教授，博士。

E-mail: shixingbo123@aliyun.com

2016—07—02

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.046

鄧潔紅(1967—)，女，湖南農業大學教授，博士。

E-mail: hongjiedeng@163.com