核酸適配體及其在食品安全領域中的應用研究進展

張 輝 葉 華 吳世嘉 王周平

(1. 中國農村技術開發中心，北京 100045；2. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

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核酸適配體及其在食品安全領域中的應用研究進展

張 輝1葉 華2,3吳世嘉2,3王周平2,3

(1. 中國農村技術開發中心，北京 100045；2. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

文章對適配體的本質、作用機理、特點等進行了介紹，同時從固定對象及庫的構成角度分類介紹了四大類適配體篩選技術，最后，就適配體在食品安全領域中的應用現狀和發展方向作一總結和展望。

核酸適配體；篩選技術；食品安全檢測；進展

隨著人們生活水平和生活質量的不斷提高，食品的質量安全越來越受到人們的關注和重視。盡管當前中國食品安全總體形勢趨向較好，但食品安全事件仍屢有發生。有統計[1]表明，僅2016年第一季度，中國大陸累計發生了近4 000起食品安全事件，平均發生率達43.8起/d。而產生這些食品安全事件的主要風險因子包括農獸藥殘留、致病性微生物、重金屬超標、物理性異物及違規使用食品添加劑、非法添加違禁物等。當前對這些風險因子的監測方法雖然技術上比較成熟，但在應用方面有一定的局限性，難以滿足現場快速檢測的要求。如農獸藥殘留的氣液相色譜法樣品前處理要求嚴格、毛細管電泳法重復性差、致病菌的平板分離法耗時長、免疫檢測法易出現假陽性等。因此，快速、靈敏、高效的食品風險因子檢測方法一直是學者們研究和開發的重點。

近年來，適配體(aptamer)的出現為食品安全快速檢測技術的實現開辟了一條新的路徑。有學者[2]認為，凡是涉及抗體的應用領域，幾乎都可以用適配體代替。因此，適配體又稱為“化學抗體”[3]。作為一種新型的仿生識別分子，核酸適配體能選擇性地特異結合靶標分子。由于其具有靶分子范圍廣、可體外化學合成、穩定性好、制備及修飾方便、成本低等優點，而廣泛應用于醫療診斷、環境監測、生物分析等眾多領域。當前，適配體在食品安全領域的研究報道越來越多，但多集中在某一具體方面[4-7]。本文擬從適配體的本質、作用機理及特點入手，介紹蛋白質、細胞等5大類適配體，同時闡述適配體篩選技術流程并對其進行分類，最后就適配體在食品安全領域中的應用現狀和發展方向作一總結和展望。

1 核酸適配體概述

1.1 核酸適配體的本質

適配體最早由Ellington等[8]于1990年提出，他們將體外篩選試驗中得到的能特異性結合有機染料的RNA序列稱之為aptamers。之后，人們又成功篩選到許多對各自靶標有特異性和親和力的DNA或RNA適配體。進一步研究[9]表明，適配體之所以能特異性結合靶標，可能是它在某種條件下能折疊形成特定的三維結構。因此，核酸適配體本質上是一段具有特定復雜三維結構并能特異性結合靶標分子的單鏈DNA或RNA序列，一般長度在10～100個堿基之間。

1.2 核酸適配體的作用機理及特點

由于適配體是一段短的單鏈核酸序列，它可以通過氫鍵作用、靜電作用、堿基堆積作用、范德華力以及構象互補等方式，形成發夾、G四聚體、莖環、假結等穩定的結構與靶標分子特定區域結合，從而對靶標分子具有較高的特異性和較好的親和性[10]。

適配體與不同大小的靶標分子作用方式有可能不同, 但基本原理相似。一般認為，適配體結合于大分子的某一特定部位(圖1)，而小分子則主要是結合在適配體三維結構的某一特定部位(圖2)。雖然適配體與靶標分子的具體作用機理尚未得到證實，但是與傳統的抗體相比，適配體具有靶分子廣、親和力高、特異性強、可重復利用、穿透性好、免疫原性小、易于修飾、方便合成等眾多優點。

圖1 核酸適配體與大分子靶標相互作用示意圖

圖2 核酸適配體與小分子靶標相互作用示意圖[9]

1.3 核酸適配體的種類

經過近30年的發展，目前已經報道的核酸適配體已超過560余種[11]。隨著對適配體研究的不斷深入，適配體的種類還將進一步得到擴展[12]。當前有關適配體的研究和進展報道越來越多，但都沒有系統地將其進行分類。本文在現有研究的基礎上將適配體分為以下5類進行介紹。

1.3.1 蛋白質適配體 蛋白質是生命物質的基礎，是人體一切細胞、組織的重要組成部分，很多生命現象均與蛋白質有關。因此，蛋白質適配體自然是適配體研究的熱點。第一個報道[13]的適配體即是蛋白質適配體(T4 DNA聚合酶RNA適配體)。近年來，已報道[4]的蛋白質類適配體主要包括生長因子、酶、激素、毒素、細胞表面受體、微生物蛋白質等。目前，蛋白質適配體在醫學成像[14-15]、疾病診斷與治療[16]、藥物研發[17]、生物安全檢測[18]等方面應用較多。另外，第一個也是目前唯一一個獲得美國FDA批準的適配體藥物Macugen(pegaptanib sodium，哌加他尼鈉)也是蛋白質適配體[17]。

1.3.2 細胞適配體 細胞是生物體基本的結構和功能單位，具有運動、營養和繁殖的機能。因此人們對其研究比較重視，但是由于細胞結構比較復雜，其表面分子形態比較特殊，即使將它們分離純化用來檢測，其實際檢測效果也可能出現假陽性，這就限制了對細胞表面的分子水平方面的研究。而細胞適配體的出現有可能突破這一限制。目前報道的細胞適配體主要包括癌細胞、炎癥細胞和感染細胞等，尤其是癌細胞適配體居多，如呼吸系統癌細胞、消化系統癌細胞、生殖系統癌細胞、血液系統癌細胞等[5]。

1.3.3 抗生素適配體 抗生素是一類由細菌、霉菌或其他微生物在生活過程中所產生的具有不同抗病原體的抗生素藥物或其他活性物質，可用于治療各種非病毒感染，包括鏈霉素、青霉素、多粘菌素、四環素等。但近期很多研究[19]表明，使用抗生素容易產生許多副作用，如導致細菌產生抗藥性等。而以抗生素適配體作為一種識別原件來檢測抗生素殘留，具有比抗體檢測更好的優越性。因此，近年來篩選到的抗生素適配體有四環素[20]、卡那霉素A[21]、卡那霉素B[22]、鏈霉素[23]等。

1.3.4 細菌適配體 細菌無處不在，廣泛存在于空氣、水、土壤甚至食物。細菌對人類、動物以及環境的影響是雙面的，但某些細菌尤其是致病菌給人們的生活和健康帶來較大的危害，如容易引起食源性疾病的沙門菌、容易造成腹瀉和敗血癥的大腸桿菌等。而篩選這類有害的細菌適配體有利于對其進行有效地分析和檢測。目前關于沙門菌[24]、大腸桿菌[25]、金黃色葡萄球菌[26]、副溶血性弧菌[27]、李斯特菌[28]、阪崎腸桿菌[29]等細菌的適配體報道較多。當前，細菌適配體的應用還難以達到實際期望值，因此，篩選更好的細菌適配體以滿足實際需求仍需要更大的發展空間。

1.3.5 金屬離子適配體 金屬離子有些是維持多相體系滲透平衡的主要組成部分，有些是酶活性中心的組成部分，有些酶分子雖然不含金屬離子，但缺少金屬離子，其催化能力喪失或較低。另外在工業生產過程中由于未經科學處理一些重金屬離子被直接排放到環境中，極易造成重金屬離子污染，對環境、農作物產生極大的危害。因此這類金屬離子尤其是重金屬離子的適配體也是人們篩選的熱點。目前，已報道的金屬離子適配體有K+、Zn2+、Hg2+、As3+、Pb2+、Cd2+等[6，30-31]。

1.3.6 其他小分子適配體 最先提出aptamer概念的Ellington等[8]就是第一個以小分子(有機染料)為靶分子來篩選適配體的，他們不但成功地篩選得到了有機染料小分子適配體，還證明了這些適配體對6種不同但非常相關的有機染料能特異性識別，表明這些適配體對染料靶標具有較高的特異性，對其他染料則沒有。這為人們對小分子的篩選奠定了良好的基礎。從篩選技術角度來說，相對于大分子適配體，小分子適配體較難篩選，但目前篩選成功的小分子適配體除有機染料外，熒光染料、核苷酸、核苷、堿基、氨基酸、糖和一些輔助因子的適配體等[32]均有報道。

2 核酸適配體篩選技術流程和分類

2.1 核酸適配體篩選技術流程

獲得適配體的篩選技術稱之為SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指數富集的配體系統進化)，這個概念最早由Tuerk等[14]提出。SELEX技術擺脫了對生物系統的依賴性，完全是一種在體外進行的組合化學方法。其基本流程見圖3，主要包括孵育、分離、洗脫、PCR擴增、選擇、克隆測序、序列分析等步驟。

圖3 SELEX技術基本流程

2.2 核酸適配體的篩選技術分類

SELEX技術的關鍵是如何回收所需要的適配體，換句話說，就是適配體與靶標物質的分離效果決定了篩選的效率。近年來科研工作者將一些新的試驗技術和新的理念注入到傳統的SELEX技術中，開發出了許多新型SELEX技術，如：毛細管電泳SELEX、基因SELEX、細胞SELEX等[7]。但目前有關SELEX技術沒有具體的分類方法，這里在分離技術的基礎上，根據待固定對象及庫的構成將其分為以下四大類。

2.2.1 固定靶標的適配體篩選技術 固定靶標的適配體篩選技術，顧名思義，就是將待篩選的目標物質固定在一定的基質上，然后將寡核苷酸文庫與其進行孵育，使兩者結合，再通過一定的分離方法將其分離從而進行篩選。目前大多數篩選方法都是將靶標固定，常用的固定基質有瓊脂糖凝膠、磁珠納米顆粒、聚丙烯微孔板、芯片等，這種方法的前提條件是靶標分子必須有固定位點，如有氨基或羧基等基團的存在。陳秀娟[33]將玉米赤霉烯酮、伏馬菌素B1活化后，分別固定在氨基化的磁珠上，利用磁珠-SELEX技術分別經過14輪和13輪篩選成功得到玉米赤霉烯酮和伏馬菌素B1的適配體。如果靶標物質沒有固定位點則需要進行修飾后方可固定，但是并不是所有的靶標物質都能修飾。另外，修飾后的靶標與天然的靶標在結構等方面有一定的區別，也許這個區別對適配體的應用存在不利影響。

2.2.2 固定文庫的適配體篩選技術 在實際篩選中，有些靶標分子因為沒有適合的固定位點，所以不能用上述方法進行篩選。而且在實際檢測中，有時無法固定樣品中的待測物質，從而導致利用適配體的檢測技術所得到的結果與實際情況不符。因此，將文庫進行固定、靶標游離的篩選方法即固定文庫的適配體篩選技術應運而生，這類篩選方法有學者將其稱為捕獲-SELEX(Capture-SELEX)[21]。它的固定基質和固定靶標所用的基質基本相同。Nutiu等[34]將文庫固定在親和素包被的磁珠上，成功地篩選得到ATP(16輪)和GTP(18輪)的適配體。Wu等[30]將文庫固定在鏈酶親和素標記的瓊脂糖顆粒上，經過10輪的正篩和1輪的反篩得到28個克隆體，并對其進行測序得到12條非重復序列的適配體，這些適配體均不同程度地特異性識別Cd2+，而且不能識別其他金屬離子，其中Cd-4適配體結合能力最強，其解離常數Kd值達34.5 nmol/L。

2.2.3 非固定靶標或文庫的適配體篩選技術 無論是固定靶標還是固定文庫，或多或少地都會對適配體或靶標的天然結構產生一定的影響，如改變適配體或靶標的三維結構，會導致實際檢測效果不好。因此，在篩選過程中，保持靶標或適配體的天然狀態有利于提高適配體的應用效果。而這一類篩選方法比較有代表的就是硝酸纖維素膜篩選[35]、毛細管電泳篩選[36]、氧化石墨烯篩選法[37]等。

2.2.4 人工擴展的基因信息系統篩選技術 目前SELEX技術所使用的基因文庫大多是ATGC(ssDNA文庫)或AUGC(RNA文庫)化學合成的，而且篩選出了很多不同靶標的適配體，并取得了一定的效果。科研工作者們對SELEX技術的改進起初都是從下游著手的，如對篩選得到的適配體加以修飾改造，提高適配體的穩定性等，后來逐漸對文庫加以修飾或標記，如在核苷酸上加入功能基團等。最近有學者[38]根據堿基配對原則合成了新的堿基，Sefah 等[39]選擇其中一種新配對堿基用來構建了一種新的文庫，并將這種篩選技術稱之為人工擴展遺傳信息系統-SELEX (Artificially expanded genetic information systems，AEGIS-SELEX)。在ATGC的基礎上增加了ZP兩個堿基(ZP配對)，構建了ATGCZP 6個堿基的文庫，以該文庫篩選12輪得到了乳房癌細胞MDA-MB-231的適配體，該適配體序列中僅含有1個Z和1個P。Sefah等[39]通過進一步研究發現，如果Z或P被其他堿基(ATGC)所取代，則其親和力降低甚至消失；該文庫的使用能夠降低篩選輪數、提高適配體的親和力，具有很大的應用前景。

3 核酸適配體在食品安全領域中的應用

3.1 在食源性致病菌檢測方面的應用

傳統的食源性致病菌檢測方法主要是微生物檢驗技術、儀器分析法、分子生物學技術和免疫學檢測方法等。近年來，基于適配體的食源性致病菌的檢驗方法報道越來越多。Joshi 等[40]利用SELEX技術篩選得到鼠傷寒沙門氏菌DNA適配體，并結合實時定量RT-PCR法對食品樣品和環境樣本中的沙門氏菌進行了檢測，檢測限在4～40 CFU/mL。Duan等[41]利用whole-bacterium-SELEX技術，篩選得到了高親和力的鼠傷寒沙門氏菌適配體，并以此適配體為識別元件，結合熒光技術構建了一種測定檢測鼠傷寒沙門氏菌的新方法(圖4)，該方法對目標菌具有良好的線性響應，其線性檢測范圍為50～106CFU/mL，檢測限達25 CFU/mL。Duan等[42]還結合表面增強拉曼光譜技術建立了適配體傳感器用來檢測副溶血弧菌，其線性檢測范圍為10～106CFU/mL，檢測限達10 CFU/mL。

圖4 基于適配體的熒光生物法檢測鼠傷寒沙門氏菌原理圖[41]

Figure 4 Principle of detectingSalmonellatyphimuriumby the fluorescent bioassay based on aptamer[41]

3.2 在生物毒素檢測方面的應用

近年來，基于適配體的生物毒素的檢測方法已有報道。Aguado等[43-45]篩選得到了赭曲霉毒素A(OTA)核酸適配體并初步應用于檢測OTA，通過比較，檢測限最低可低至1 nmol/L。Huang等[46-47]利用磁珠法篩選得到金黃色葡萄球菌腸毒素A和C1的適配體，建立了基于氧化石墨烯—熒光共振能量轉移效應的一種快速、準確且方便的用于牛奶中SEA和復原乳中SEC1定量檢測方法，檢測限分別為8.7 ng/mL和6.0 ng/mL。Bruno等[48]將篩選到的金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)適配體結合電化學發光法用于檢測SEB，其檢測限達到10 pg。Amanda 等[49]采用親和探針毛細管電泳技術建立了基于熒光標記的RNA適配體檢測方法，對蓖麻毒素進行定量分析和檢測，研究表明，即使加入RNAse A來降解適配體，其檢測限能達到10-9mol/L，說明該檢測體系中適配體具有較好的穩定性。

3.3 在重金屬離子檢測中的應用

Miyake等[50-51]報道了Hg2+的篩選，他們用試驗證明了所篩選得到的適配體對T堿基有很強的選擇性，據此推測該適配體和靶標Hg2+之間的相互作用是通過T- Hg2+-T的堿基配對方式結合的。此后，有關基于核酸適配體技術檢測Hg2+的研究報道越來越多。Wang 等[52]利用這一結合原理，利用含有T堿基的凝血酶適配體成功構建了基于適配體和納米金探針的色度傳感器來檢測Hg2+，其檢測限達200 nmol/L。凌紹明等[53]將核酸適配體修飾納米金作為探針，利用共振散射光譜法建立了快速、靈敏的Pb2+的檢測方法(圖5)，其檢出限達0.03 nmol/L。

Kim等[54]利用親和柱技術進行體外篩選得到砷的核酸適配體，并通過構型轉換形成特定的二級結構用于檢測地下水中As3+和As5+，其結合常數分別達到7 nmol/L和5 nmol/L。Wu等[55]建立了一種基于核酸適配體的新型雙重熒光共振能量轉移同步檢測Hg2+和Pb2+的檢測系統，實現了同時檢測兩種金屬離子，不僅縮短了檢測時間、降低了檢測成本，還提高了檢測效率。該系統采用雙色上轉換納米粒子作為供體，納米金粒子作為受體，根據上轉換熒光強度的變化分別同時檢測受污染樣品和人血清樣品中的Pb2+和Hg2+，結果表明，其檢測限分別達到50，150 pmol/L，具有較高的靈敏度。

圖5 適配體納米金共振散射光譜探針檢測Pb2+原理圖

3.4 在藥物殘留檢測方面的應用

食品中抗生素、農藥殘留的檢測越來越受到人們的重視，基于適配體的檢測方法不僅穩定性好，而且靈敏度高，具有較好的應用前景。廖且根等[56]將卡那霉素適配體修飾銀納米粒子，并以此作為探針，利用共振光散射技術檢測卡那霉素，結果表明，該方法表現出了極高的選擇性和特異性，其檢測限為1.0 mg/kg。Yadav 等[57]將篩選得到的氯霉素DNA適配體，制備了基于適配體的電化學傳感器對氯霉素進行了檢測，也表現了良好的特異性和靈敏度，其檢測限為0.02 nmol/L。Wang等[58]將文庫固定在凝膠上，利用Capture-SELEX技術同時篩選甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果4種有機磷農藥的核酸適配體，經過12輪篩選，最終得到5條核酸適配體，其中SS2-55和SS2-54兩個適配體對4種農藥具有較強的結合能力和較高的特異性，其平衡解離常數在0.83～2.50 mmol/L，因此，推測篩選得到的適配體有可能是結合4種有機磷農藥的廣譜型適配體。

4 總結與展望

核酸適配體發展近30年來，相關篩選技術越來越豐富，人們對適配體認識也越來越深入，適配體在實際應用中尤其是在食品安全檢測方面取得了明顯的成效，如降低了檢測成本、縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度等。而且已有商品化的細菌、毒素的適配體檢測試劑盒問世，這些產品的出現不僅證明了適配體在檢測應用方面的優勢，更降低了食品安全事件發生的概率。

但要使適配體成為食品安全保駕護航的有力工具，不僅在檢測方面發揮作用，更重要的是在食品安全控制方面要有所建樹，而在這方面的研究和報道很少。另外，要正視適配體在實際發展過程中面臨著的一些問題，如核酸適配體的高效篩選難以實現，適配體與靶標相互作用的機理和構效關系急需闡明等。要解決這些問題，適配體今后的發展重點應該有以下三個方面：① 適配體高效篩選方法的突破；② 適配體與靶分子相互作用機制的揭示；③ 適配體在食品安全控制方面的應用。相信在科學家們的不斷努力下，適配體作為一種新興組合化學技術，其優勢與應用必將在食品安全檢測和控制領域得到進一步的發展。

[1] 江南大學國家社科重大課題《食品安全風險社會共治研究》研究團隊. 1-3月我國食品安全事件分析[N]. 中國食品安全報, 2016-5-12(A2).

[2] 滿燕, 呂雪飛, 張玉奎, 等. 核酸適配體及其在生物醫學研究中的應用[J]. 航天醫學與醫學工程, 2013, 26(6): 485-490.

[3] GOLD L. Conformational properties of oligonucleotides[J]. Nucleic Acids Symposium, 1995(33): 20-22.

[4] 楊歌, 魏強, 趙新穎, 等. 蛋白質的核酸適配體篩選的研究進展[J]. 色譜, 2016, 34(4): 370-381.

[5] 劉品多, 屈鋒. 全細胞的核酸適配體篩選的研究進展[J]. 色譜, 2016(4): 382-388.

[6] 于寒松, 隋佳辰, 代佳宇, 等. 核酸適配體技術在食品重金屬檢測中的應用研究進展[J]. 食品科學, 2015, 36(15): 228-233.

[7] 王周平, 張維瀟. 適配體及其研究進展[J]. 食品與生物技術學報, 2013, 32(9): 897-906.

[8] ELLINGTON A D, SZOSTAK J W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J]. Nature, 1990, 346: 818-822.

[9] HERMANN T, PATEL DJ. Biochemistry-Adaptive recognition by nucleic acid aptamer[J]. Science, 2000, 287(5 454): 820-825.

[10] 段諾. 食源性致病菌適配體的篩選及分析應用研究[D]. 無錫: 江南大學, 2013: 5.

[11] MCKEAGUE M, MCCONNELL E M, CRUZ-TOLEDO J, et al. Analysis of in vitro aptamer selection parameters[J]. Journal of Molecular Evolution, 2015, 81(5/6): 150-161.

[12] 徐發良, 肖覺. SELEX技術的靶標范圍拓展[J]. 第二軍醫大學學報, 2012, 33(4): 432-435.

[13] TUERK C, GOLD L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J]. Science, 1990, 249: 505-510.

[14] JACOBSON O, YAN Xue-feng, NIU G, et al. PET imaging of tenascin-C with a radio labeled single-stranded DNA aptamer[J]. Journal of Nuclear Medicine, 2015, 56(4): 616-621.

[15] ZENG Zi-hua, PAREKH Parag, LI Zheng, et al. Specific and sensitive tumor imaging using biostable oligonucleotide aptamer probes[J]. Theranostics, 2014, 4(9): 945-952.

[16] LE TRINH T, ZHU Gui-zhi, XIAO Xi-lin, et al. A synthetic aptamer-drug adduct for targeted liver cancer therapy[J]. PLOS ONE, 2015, 10(11): doi:10.1371/journa.pone.0136673.

[17] NG E W M, SHIMA D T, CALIAS P, et al. Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2006, 5(2): 123-132.

[18] HUANG Yu-kun, CHEN Xiu-juan, WU Shi-jia, et al. Homogeneous time-resolved fluorescence assay for the detection of ricin using an aptamer immobilized on europium-doped KGdF4 nanoparticles and graphene oxide as a quencher[J]. Microchimica Acta, 2015, 182(5/6):1 035-1 043.

[19] 朱亞寶, 劉曉富, 翟麗芳, 等.細菌耐藥性與抗生素的合理使用[J]. 檢驗醫學與臨床, 2010, 7(3): 286-288.

[20] NIAZI J H, LEE Su-jin, GU Man-bock. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 16(15): 7 245-7 253.

[21] STOLTENBURG R, NIKOLAUS N, STREHLITZ B. Capture-SELEX: Selection of DNA aptamers for Aminoglycoside antibiotics[J]. Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2012(1): 155-166.

[22] KWON M, CHUN S M, JEONG S, et al. In vitro selection of RNA against kanamycin B[J]. Molecules and Celles, 2001, 11(3): 303-311.

[23] ZHOU Nan-di, WANG Jing-yuan, ZHANG Juan, et al. Selection and identification of streptomycin-specific single-stranded DNA aptamers and the application in the detection of streptomycin in honey[J]. Talanta, 2013, 108: 109-116.

[24] DUAN Nuo, WU Shi-jia, CHEN Xiu-juan, et al. Selection and characterization of aptamers against salmonella typhimurium using whole-bacterium systemic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)[J]. J. Agric. Food Chem., 2013, 61: 3 229-3 234.

[25] LEE YJ, HAN SR, MAENG JS, et al. In vitro selection of Escherichia coli O157:H7-specific RNA aptamer[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 417(1): 414-420.

[26] HAN SR, LEE SW. In vitro selection of RNA aptamer specific to Staphylococcus aureus[J]. Annals of Microbiology, 2014, 64(2): 883-885.

[27] DUAN Nuo, WU Shi-jia, CHEN Xiu-juan, et al. Selection and identification of a DNA aptamer targeted to Vibrio parahaemolyticus[J]. J. Agr. Food Chem., 2012, 60: 4 034-4 038.

[28] DUAN Nuo, DING Xiao-ying, HE liang-xing, et al. Selection, identification and application of a DNA aptamer against Listeria monocytogenes[J]. Food Control, 2013, 33(1): 239-243.

[29] 韓曉曉. 阪崎腸桿菌適配體制備及其應用[D]. 無錫: 江南大學, 2013: 17.

[30] WU Yuan-gen, ZHAN Shen-shan, WANG Lu-mei, et al. Selection of a DNA aptamer for cadmium detection based on cationic polymer mediated aggregation of gold nanoparticles[J]. Aanlyst, 2014, 139(6): 1 550-1 561.

[31] CHEN Zheng-bo, CHEN Liang, MA He, et al. Aptamer biosensor for label-free impedance spectroscopy detection of potassiumion based on DNA G-quadruplex conformation[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 48: 108-112.

[32] SVEN Klussmann. 核酸適配體手冊: 功能性寡核苷酸及其應用[M]. 屈鋒, 譯. 北京: 化學工業出版社, 2013: 84-99.

[33] 陳秀娟. 鐮刀菌毒素核酸適配體的篩選及分析應用研究[D]. 無錫: 江南大學, 2015: 44，60.

[34] NUTIU R, LI Ying-fu. In vitro selection of structure-switching signaling aptamers[J]. Angewandte Chemie-International Edition,2005,44(7):1 061-1 065.

[35] 劉曉靜. SELEX技術篩選人TGF-b RⅡ親和核酸庫方法的建立[D]. 重慶: 第三軍醫大學, 2004: 12-19.

[36] MENDONSA S D, BOWSER M T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis[J]. Journal of the American Chemical Society, 2004, 126(1): 20-21.

[37] GU Hua-jie, DUAN Nuo, WU Shi-jia, et al. Graphene oxide-assisted non-immobilized SELEX of okdaic acid aptamer and the analytical application of aptasensor[J]. Scientific Reports, 2016, 6: doi:10.1038/srep21665.

[38] BENNER S A. Understanding nucleic acids using synthetic chemistry[J].Accounts of Chemical Research, 2004, 37(10): 784-797.

[39] SEFAH K, YANG Zun-yi, BRADLEY K M, et al. In vitro selection with artificial expanded genetic information systems[J]. PNAS, 2014, 111(4): 1 449-1 454.

[40] JOSHI R, JANAGAMA H, DWIVEDI HP, et al. Selection, characterization, and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars[J]. Molecular and Cellular Probes, 2009, 23(1): 20-28.

[41] DUAN Nuo, WU Shi-jia, CHEN Xiu-juan, et al. Selection and characterization of aptamers against Salmonella typhimurium using whole-bacterium systemic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX) [J]. Jouranl of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61: 3 229-3 234.

[42] DUAN Nuo, YAN Yi-ling, WU Shi-jia, et al. Vibrio parahaemolyticus detection aptasensor using surface-enhanced Raman scattring[J]. Food Control, 2016, 63: 122-127.

[43] CRUZ-AGUADO JA, PENNER G. Determination of Ochratoxin A with a DNA aptamer[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(22): 10 456-10 461.

[44] 段諾, 吳世嘉, 王周平. 核酸適配體識別熒光法檢測赭曲霉毒素A[J]. 分析化學, 2011, 39(3): 300-304.

[45] PARK J H, BYUN J Y, MUN H, et al. A regeneratable, label-free, localized surface Plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2014, 59: 321-327.

[46] HUANG Yu-kun, CHEN Xiu-juan, XIA Yu, et al. Selection, identification and application of a DNA aptamer against staphylococcus aureus enterotoxin A[J]. Analytical Methods, 2014, 6(3): 690-697.

[47] HUANG Yu-kun, CHEN Xiu-juan, DUAN Nuo, et al. Selection and characterization of DNA aptamers against staphylococcus aureus enterotoxin C1[J]. Food Chemistry, 2015, 166: 623-629.

[48] BRUNO J G, KIEL J L. Use of magnetic beads in selection and detection of biotoxin aptamers by electrochemiluminescence and enzymatic methods[J]. Biotechniques, 2002, 32(1): 178-180,182-183.

[49] HAES A J, GIORDANO B C, COLLINS G E. Aptamer-based detection and quantitative analysis of ricin using affinity probe capillary electrophoresis[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(11): 3 758-3 764.

[50] MIYAKE Y, TOGASHI H, TASHIRO M, et al. MercuryⅡ-mediated formation of thymine-HgⅡ-Thymine base paris in DNA duplexes[J]. Journal of the American Chemical Society, 2006, 128(7): 2 172-2 173.

[51] TANAKA Y, ODA S, YAMAGUCHI H, et al. 15N-15N J-coupling across HgⅡ: Direct observation of HgⅡ-Medeated T-T base pairs in a DNA duplex[J]. Journal of the American Chemical Society, 2006, 129(2): 244-245.

[52] WANG Yong, YANG Fan, YANG Xiu-rong. Colorimetric biosensing of mercuryⅡ ion using unmodified gold nanoparticle probes and thrombin-binding aptamer[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2010, 25(8): 1 994-1 998.

[53] 凌紹明, 范燕燕, 蔣治良, 等. 核酸適配體修飾納米金共振散射光譜探針快速檢測痕量Pb2+[J]. 化學學報, 2010, 68(4): 339-344.

[54] KIM M, UM H J, BANG S, et al. Arsenic removal from Vietnamese groundwater using the arsenic-binding DNA aptamer[J]. Environmental Science & Technology, 2009, 43(24): 9 335-9 340.

[55] WU Shi-jia, DUAN Nuo, SHI Zhao, et al. Dual fluorescence resonance energy transfer assay between tunable upconversion nanoparticles and controlled gold nanoparticles for the simultaneous detection of Pb2+and Hg2+[J]. Chemistry Aanlytical, 2014, 128: 327-336.

[56] 廖且根, 李偉紅, 張金艷, 等. 基于核酸適配體與銀納米粒子探針共振光散射技術檢測卡那霉素[J]. 農產品質量與安全, 2012(S1): 17-19.

[57] YADAV S K, AGRAWAL B, CHANDRA P, et al. In vitro chloramphenicol detection in a Haemophilus influenza model using an aptamer-polymer based electrochemical biosensor[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2014, 55: 337-342.

[58] WANG Li, LIU Xian-jin, ZHANG Qiang, et al. Selection of DNA aptamers that bind to four organophosphorus pesticides[J]. Biotechnology Letters, 2012, 34(5): 869-874.

Progress on application of aptamers on food safety detection

ZHANGHui1YEHua2,3WUShi-jia2,3WANGZhou-ping2,3

(1.ChinaRuralTechnologyDevelopmentCenter,Beijing100045,China;2.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;3.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

This review mainly focuses on the progress on the application of aptamers on food safety detection. Firstly, the nature, mechanism and characteristics of aptamers were introduced; Secondly, four types of SELEX technology from the angle of the fixed objects and the composition of library were classified; finally, the application and development of aptamers in food safety detection were reviewed and prospected.

Aptamers; SELEX; food safety detection; progress

國家自然科學基金項目(編號：21375049)

張輝，男，中國農村技術開發中心副研究員，博士。

王周平(1974—)，男，江南大學教授，博士。

E-mail: wangzp1974@163.com

2016—07—17

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.043