基于多肽識別基團的熒光探針及其對食品中氰化物的檢測

周彬彬 汪霞麗 王芳斌 張繼紅 楊 滔 程云輝 郝遠強

(1. 湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410117；2. 長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114；3. 商丘師范學院化學化工學院，河南 商丘 476000)

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基于多肽識別基團的熒光探針及其對食品中氰化物的檢測

周彬彬1汪霞麗1王芳斌1張繼紅1楊 滔1程云輝2郝遠強3

(1. 湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410117；2. 長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114；3. 商丘師范學院化學化工學院，河南 商丘 476000)

食品；氰化物；多肽；熒光探針；檢測

氰化物是嚴重危害食品安全的劇毒化合物，能與細胞線粒體內高鐵細胞色素氧化酶結合，生成氰化高鐵細胞色素氧化酶，從而失去傳遞氧的作用，造成人體組織缺氧窒息，引起組織衰竭以至機體死亡[1]。研究[2]表明：口服氰化鈉、氰化鉀的致死量為1～2 mg/kg，口服氫氰酸致死量為0.7～3.5 mg/kg。氰酸鹽是氰化物的主要存在形式，被大量應用于電鍍、冶煉等行業，造成環境的污染，從而產生食品安全隱患。另外，含菜豆亭堿的四季豆、五色豆等豆類，以及含氰甙的竹筍、苦杏仁、木薯及其相關制品等食品中也含有氰化物，能引起急性中毒[3]。因此，食品中氰化物的檢測是一項重要的安全檢測指標，也是一項常規檢測指標。

在現行國家標準中，氰化物的檢測通常采用分光光度法，以吡啶—巴比妥酸、異煙酸—吡唑酮、異煙酸—巴比妥酸等作為顯色體系。但該法針對不同的樣品需采取不同的處理方法，實際工作中若采用相同的試劑處理樣品對檢測結果影響很大，且該法前處理操作較復雜，部分樣品毒性較大[4-7]。近年來，學者們研究了色譜法、光譜法、離子色譜—脈沖安培檢測法、銀明膠絡合法、電化學法、硝酸銀滴定法、及快速檢測試紙條法等在氰化物檢測方面的應用，這些技術與傳統的分光光度法相比，都具備各自特有的優勢。如色譜法和光譜法靈敏度更高，試劑用量少[1]；離子色譜—脈沖安培檢測法線性范圍寬、檢出限低[8]；銀明膠絡合法選擇性好[9]；電化學法操作簡便[10]；硝酸銀滴定法重現性好。然而，這些方法都存在耗時較長，影響因素較多、對檢測人員素質要求高等問題。且色譜法、離子色譜—脈沖安培法儀器較貴，電化學法、硝酸銀滴定法易受食品中復雜成分的干擾。因而這些方法都沒能在食品中氰化物檢測方面受到廣泛推廣應用。另外，現有的氰化物試紙條檢測方法雖然具備現場快速定性的優點[11]，但是，其目前的靈敏度不足以達到世界衛生組織對飲用水中氰化物含量檢測濃度的規定[12]，且當其針對食品中氰化物進行檢測的時候，又易受到食品中其它復雜成分的干擾。

熒光探針法，因其具有高選擇性、高靈敏度、反應速度快等特點，在食品安全檢測方面被廣泛應用[13-15]。近年來，熒光探針法在氰化物的檢測方面，也展現出了潛在的優勢[16-17]，研究者們設計了熒光探針分子對水中的氰化物進行了檢測，都展現出了較高的靈敏度和選擇性。但目前用于氰化物檢測的熒光探針分子往往存在水溶性較差，不利于實際應用等問題，而且大部分都是基于人工合成的識別基團，因此帶來探針分子合成繁瑣以及生物相容性不好等問題。已有研究[18]表明，將多肽與香豆素結合而得到的熒光探針分子展現出了很好的生物相容性和水溶性。

本研究設計將香豆素(Coumarin, C)骨架與甘氨酸-甘氨酸-組氨酸三肽(Gly-Gly-His，GGH)縮合得到熒光探針分子(C-GGH)，此探針的生色團為香豆素結構，識別基團為GGH三肽。利用探針分子識別基團與Cu2+絡合形成復合物(命名為C-GGH-Cu2+)使熒光淬滅，而復合物C-GGH-Cu2+在CN-的存在下，通過CN-與Cu2+的絡合形成更加穩定的絡合物，體系熒光又得到恢復的原理，從而實現對食品中氰化物的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

甘氨酸、組氨酸、DIC、HOBt：分析純，吉爾生化上海有限公司；

硫酸銅、7-二乙胺基香豆素-3羧酸：分析純，上海安耐吉化學有限公司；

用于干擾性試驗的其它陰離子四丁基銨鹽類：分析純，薩恩化學技術(上海)有限公司；

用于合成的有機溶劑：分析純，天津大茂化學試劑廠；

1.1.2 樣品的采集

研究過程中的食物樣本為本單位監督抽檢過程中所抽取的樣品，檢驗過程中發現氰化物含量較高的樣品，留樣進行本試驗研究；部分種類樣品采取加標方式。

1.2 儀器與設備

熒光分光光度計：F-2500型，日本日立公司；

核磁共振譜儀：AMX-400型，瑞士Bruker公司；

高分辨質譜儀：LCQ Fleet型，美國Thermo-Fisher公司；

紫外可見分光光度計：UV2450型，日本島津公司；

高效液相色譜儀：6AD型，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 GGH三肽的合成 GGH三肽的合成照參文獻[19]，利用HOBt和DIC通過標準的多肽液相合成法來合成，合成產率為67%。

1.3.2 C-GGH熒光探針的合成 將7-二乙胺基香豆素-3-羧酸(522 mg，2 mmol)室溫條件下加入DMF(10 mL)中，攪拌下加入DIC (2 mmol)，HOBt ( 2 mmol)活化反應1 h。將含有三肽GGH (538 mg，2 mmol)的DMF(10 mL)溶液緩慢滴入到上述反應液中，繼續室溫攪拌反應3 h。待反應結束后，向最終反應液中加入冰乙醚(80 mL)，析出黃色沉淀。在冷凍條件下高速離心并收集沉淀產物。用高效液相色譜分離純化粗產物，得到黃色固體產物789 mg (收率：77%)。

1.3.3 產物表征 核磁共振氫譜(1H-NMR)表征：共振頻率為500 MHz，D2O重水作為溶劑，TMT作為內標物，室溫進行掃描。質譜(ESI-MS)表征：采用電噴霧離子源(ESI)形式，選擇正離子模式，掃描范圍為從100～1 000m/z。

1.3.4 氰化物的檢測 將合成的熒光探針分子C-GGH (1.0 μmol/L)溶解于水體系的HEPES緩沖溶液中(pH=10.0)中，加入等濃度的銅離子(1.0 μmol/L)混合得到C-GGH-Cu2+溶液。然后分別加入含不同濃度氰化物的溶液后均勻混合，測試絡合物探針溶液的熒光光譜，以溶液在470 nm處的熒光發射值對氰根離子濃度作圖。作為對照，食物樣品中的氰化物含量參考GB/T 5009.48—2003、GB/T 5009.36—2003和GB/T 8538—2008中規定的檢測方法進行檢測并比較。

2 結果與分析

2.1 C-GGH熒光探針分子的合成與表征

C-GGH熒光探針分子的合成路線見圖1。7-二乙胺基香豆素-3-羧酸上的羧基適合標準的多肽縮合反應，可與氨基酸或多肽的氨基縮合。但考慮到香豆素的位阻效應可能會影響到下一步反應的產率，本研究中先合成GGH三肽，再與7-二乙胺基香豆素-3-羧酸縮合。另一方面，為了避免縮合過程中出現GGH三肽分子內或自身分子間反應的情況，合成過程中先將7-二乙胺基香豆素-3-羧酸活化，再采取將GGH溶液緩慢滴入到活化反應液中的方式，整個滴加過程控制在2.5～3.0 h。

圖1 C-GGH 合成路線

液相法合成以后，向反應液中加入冰乙醚析出固體，再用高效液相分離提純，得到純度90%以上的C-GGH。然后通過質譜對探針分子進行表征，(HRMS:m/z, calcd for [M+H]+513.209 2; found 513.208 9)，表征結果與理論值吻合。進一步的核磁表征也對合成產物進行了證實(見圖2)，1H NMR (400 Hz, D2O):δ8.49 (dd,J=20.3, 3.2 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.22～7.12 (m, 1H), 6.93 (d,J=8.9 Hz, 1H), 6.36 (d,J=8.1 Hz, 1H), 6.00 (s, 1H), 4.66～4.61 (m, 2H), 3.94 (s, 2H), 3.78 (d,J=34.7 Hz, 2H), 3.28～3.02 (m, 6H), 0.95 (t,J=6.6 Hz, 6H)。質譜和核磁的表征結果說明，通過以上所述合成路線及合成方法順利得到了C-GGH探針分子。

2.2 C-GGH-Cu2+在氰化物作用下的熒光變化

將C-GGH (1.0 μmol/L)溶解于水體系的HEPES緩沖溶液中，加入不同濃度的Cu2+(硫酸銅形式)后測試熒光光譜，發現當Cu2+濃度達到等物質的量時，C-GGH熒光基本猝滅。因此研究中選擇將1.0 μmol/L的C-GGH加入等濃度的Cu2+混合得到C-GGH-Cu2+探針溶液。然后分別加入不同濃度的氰根離子后均勻混合，測試絡合物探針溶液的熒光光譜，結果如圖3所示，隨著不同濃度氰根離子的加入，絡合物探針溶液的熒光逐漸恢復，當氰根離子的濃度達到探針分子濃度30倍時，熒光強度恢復到最大值。以溶液在470 nm處的熒光發射值對氰根離子濃度作圖見圖4，發現氰根離子濃度在0.15～15.00 μmol/L時，兩者之間呈現良好的線性關系。檢測限為0.015 μmol/L。根據GB 2757—2012、GB 2715—2005和GB 8537—2008規定，氰化物在蒸餾酒與配制酒中的限量值為8.0 mg/L(以HCN計，折算酒精度為100%)，糧食中氰化物限量值為0.015 mg/kg，自來水中限量值為0.05 mg/L，礦泉水中限量值為0.01 mg/L，以限量值要求最高的礦泉水計算，礦泉水中氰化物的限量值折算為摩爾濃度后為0.385 μmol/L，遠遠高于檢測限，說明該熒光探針分子的靈敏度足以滿足食品中氰化物的檢測。

圖2 C-GGH 核磁表征結果

圖3 1 μmol/L的C-GGH-Cu2+在不同濃度氰化物作用下的熒光變化

Figure 3 Fluorescence titration of C-GGH-Cu2+(1.0 μmol/L) with CN-(0, 0.2, 0.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, and 30 μmol/L)

圖4 C-GGH-Cu2+對氰化物檢測的標準曲線

Figure 4 Dose-dependent luminescence response of C-GGH-Cu2+(1.0 μmol/L) to CN-

2.3 C-GGH-Cu2+對氰根離子的選擇性

圖5 C-GGH-Cu2+對不同陰離子的響應圖Figure 5 Fluorescence changes of C-GGH-Cu2+ (1.0 μmol/L) upon the addition of various anions

圖6 不同陰離子的競爭檢測結果圖

Figure 6 Fluorescence responses of C-GGH-Cu2+at 478 nm in the presence of diferent anions (15.0 μmol/L) (black bars), followed by addition of CN-(15.0 μmol/L) (gray bars)

2.4 C-GGH-Cu2+對實際樣品的檢測

以上研究證明C-GGH-Cu2+探針對氰化物的檢測具有很高的靈敏度和選擇性，但食物樣品成分復雜，因此，本研究選取了酒、面粉、水等較易出現氰化物含量超標的食物樣品作為代表，將該熒光探針法與國標(GB/T 5009.48—2003、GB/T 5009.36—2003、GB/T 8538—2008)檢測方法進行對比研究，以確定該方法的準確度。由表1可知，本研究的熒光探針方法與以上國際方法相比，在對配制酒中氰化物檢測上，誤差率為2%～3%，對白酒的誤差率更低，僅為1.11%，可能因為白酒的成分相對配制酒更簡單，另外配制酒一般都帶顏色，對檢測結果也會稍有影響。面粉、自來水、礦泉水的誤差率相對稍微高點，分別為6.45%，4.81%，8.33%，原因主要為該類食品中氰化物的含量非常低，但即使有略高的誤差值，其結果也完全不會影響到對食品中氰化物含量的判定。因此，從表1中的對比研究數據可以確定，本研究中的熒光探針方法能準確檢測食品中氰化物的含量，其準確度與國標(GB/T 5009.48—2003、GB/T 5009.36—2003、GB/T 8538—2008)檢測方法一致。

表1 熒光探針對實際樣品的檢測

3 結論

本研究以甘氨酸、組氨酸、7-二乙胺基香豆素-3-羧酸為原料，采用標準多肽合成法成功合成了水溶性好的熒光探針分子C-GGH，該探針分子與等物質量的Cu2+作用形成C-GGH-Cu2+，熒光猝滅，新形成的C-GGH-Cu2+絡合物隨著氰化物的加入熒光又逐漸恢復。研究結果發現C-GGH-Cu2+對氰化物表現出了高靈敏度和高選擇性，經對實際食物樣品中氰化物進行檢測，證明該方法的準確度與國標(GB/T 5009.48—2003、GB/T 5009.36—2003、GB/T 8538—2008)檢測方法一致。該法與現有常用的食品中氰化物檢測方法相比，具有簡單、快捷、低毒性等優勢，因此，該方法在食品中氰化物的快速檢測方面具有較大的潛在應用價值。

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Devise and synthesis of fluorescent probe for cyanide detection in food based on a peptide receptor

ZHOUBin-bin1WANGXia-li1WANGFang-bin1ZHANGJi-hong1YANGTao1CHENGYun-hui2HAOYuan-qiang3

(1.HunanInstituteofFoodQualitySupervisionInspectionandResearch,Changsha,Hunan410117,China; 2.SchoolofChemistryandBiologicalEngineering,ChangshaUniversityofScienceandTechnology,Changsha,Hunan410114,China; 3.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShangqiuNormalUniversity,Shangqiu,Henan476000,China)

food; cyanide; peptide; fluorescent probe; detection

國家自然科學基金項目(編號：U1404215，31171627，31071523)；湖南省食品藥品監督管理局食品藥品安全科技項目(編號：湘食藥科R201516)

周彬彬，男，湖南省食品質量監督檢驗研究院工程師，博士。

程云輝(1964-)，女，長沙理工大學教授，博士。

E-mail: chengyh6488@sina.com

2016—08—31

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.010