短期喂食轉基因大豆對雄性大鼠睪丸StAR表達的影響

史宗勇 許冬梅 路 超 袁建琴

(山西農業大學生命科學學院，山西 太谷 030801)

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短期喂食轉基因大豆對雄性大鼠睪丸StAR表達的影響

史宗勇 許冬梅 路 超 袁建琴

(山西農業大學生命科學學院，山西 太谷 030801)

探討轉基因大豆對雄性大鼠睪丸類固醇激素合成急性調節蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)mRNA水平和蛋白水平表達的影響，為轉基因大豆的安全性提供科學依據。將30只健康雄性離乳SD大鼠隨機分成兩組，設GM組喂食含轉CP4-epsps基因大豆飼料，CK組喂食含非轉基因受體大豆(Soybean A5403)飼料，喂食試驗飼料30，60，90 d后，各組隨機處死3只大鼠，針對雄性主要生殖器官睪丸、附睪進行臟器系數分析；運用RT-PCR技術檢測大鼠睪丸StAR基因表達量；蛋白酶聯免疫反應分析大鼠睪丸StAR蛋白含量。喂食30，60，90 d后，解剖觀察大鼠，與CK組相比GM組大鼠睪丸、附睪形態、顏色正常，大小、器官間比例協調，大鼠睪丸系數無顯著性差異，附睪系數除30 d處理組(P<0.05)差異顯著外，其它各處理組間t檢驗P值均大于0.05，無顯著性差異；GM組與CK組大鼠相比，StAR基因相對表達量、蛋白含量相同處理時間組間差異不顯著。短期喂食大鼠轉CP4-epsps基因大豆，雄性大鼠主要生殖器官睪丸、附睪生長發育正常，喂食轉基因大豆對大鼠睪丸中StAR基因表達量、StAR蛋白含量無明顯影響。關鍵詞：轉基因大豆；大鼠；臟器系數；StAR

轉基因作物商品化19年來種植面積不斷擴大，2014年全球28個國家種植1.815億 hm2的轉基因作物，其中大豆種植面積占轉基因作物總面積的一半以上[1]。自轉基因生物技術誕生以來，生物安全問題引起了國際社會的激烈爭論，轉基因大豆的安全評價成為當前民眾普遍關注的科學問題和社會問題。當前轉基因生物安全評價的主要依據是國際食品法典委員會(CAC)制定的轉基因食品安全評價指南，評價內容集中在營養成分、毒理效應和過敏反應三個方面[2]。關于毒理學評價的研究主要是通過動物飼喂，圍繞其主要器官的生長發育進行研究，張力等[3]研究表明飼喂轉基因高油酸大豆對大鼠的器官發育未出現明顯的有害影響，主要臟器也未見明顯病理學改變。Qi等[4]采用轉基因大豆與傳統大豆喂養大鼠90 d后，在體重、食物消耗量、體重增重以及食物利用率上均無顯著差異。Appenzeller 等[5]以抗草甘膦大豆356?43為材料對大鼠進行神經系統的檢測，研究表明轉基因大豆對大鼠神經行為學也無顯著性影響。Batista等[6]又對大豆致敏性進行了研究，發現轉基因大豆和非轉基因大豆組未見顯著差異。此外，蘆春斌等報道了轉基因大豆對小鼠生殖系統[7]和雌鼠胚胎發育[8]無顯著影響。但尚未見喂食轉基因大豆對雄性動物性激素合成影響的研究。睪酮的合成對雄性生殖器的發育及其維持生精功能是至關重要的。在睪酮的合成過程中，膽固醇的跨膜轉運是關鍵步驟[9]。在此過程中，類固醇激素合成急性調節蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)是調節這一過程的關鍵因子。Warita等[10]研究發現小鼠StAR蛋白的缺失會引起雄性不育，當Star基因過表達時，睪酮激素顯著性上調，說明該基因對小鼠雄性的發育起至關重要的作用。睪丸間質細胞中StAR蛋白的表達與否及其表達量，勢必影響睪酮的合成和分泌，繼而影響動物的生殖生理活動。本研究擬通過比較飼喂轉CP4-epsps基因大豆及其親本大豆Soybean A5403配制飼料對大鼠睪丸組織StAR基因表達的差異，進而探討轉基因大豆對其生殖系統發育及睪丸間質細胞內分泌功能的影響，旨在為轉基因大豆對雄性大鼠生殖安全提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、儀器與試劑

1.1.1 試驗材料

SD大鼠：由山西醫科大學實驗動物中心提供；

轉CP4-epsps基因大豆為孟山都GTS40-3-2大豆，非轉基因大豆為其親本Soybean A5403大豆。轉基因成分經農業部轉基因生物產品成分監督檢驗測試中心(太原)驗證檢測確認。

1.1.2 主要儀器和試劑

電子天平：BS124S型，德國賽多利斯集團；

實時熒光定量PCR儀：IQ5型，美國Bio-Rad公司；

移液器：0.1-200 μL系列，德國Ependorf公司；

臺式高速冷凍離心機：Neofuge 25R型，香港力康發展有限公司；

酶標儀：ELx808型，美國伯騰儀器有限公司；

qRT-PCR kit：50 μL反應×120次，寶生物工程(大連)有限公司；

STAR酶聯免疫分析試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司；

DEPC水：100 mL，碧云天生物技術研究所；

三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇：分析純，天津化學試劑三廠。

1.1.3 飼料配制 大鼠飼料委托山西醫科大學實驗動物中心加工，飼料成分包括玉米(58.9%)、大豆(20%)、小麥(10%)、魚粉(6%)、骨粉(2%)、酵母(1%)、食鹽(1%)、植物油(0.9%)和蛋氨酸(0.2%)，其中試驗組飼料用轉CP4-epsps基因大豆配制，對照組飼料用Soybean A5403大豆配制，營養成分滿足《實驗動物配合飼料營養成分》(GB 14924.3—2010)要求。

1.1.4 試驗動物分組及處理 30只健康雄性離乳SD大鼠，常規飼料喂食1周適應環境后，隨機分成兩組，設喂食含轉基因大豆飼料大鼠為試驗組(GM組)，喂食含非轉基因大豆飼料大鼠為對照組(CK組)，按試驗設計分別喂食30，60，90 d后，各組隨機處死3只大鼠進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 臟器系數 喂食30，60，90 d后頸椎脫臼法處死大鼠，稱量體重，剪開腹腔，分離摘取雙側睪丸、附睪稱重(g)，依公式(臟器系數=臟器重量/大鼠體重)分別計算大鼠睪丸系數和附睪系數。去除睪丸結締組織被膜，加入一定量pH 7.4的PBS浸泡組織，用液氮迅速冷凍后移至-80 ℃冰箱冷凍保存備用。

1.2.2 RT-PCR 采用Trizol提取大鼠睪丸組織總RNA。采用RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)按照指南進行逆轉錄。Star基因PCR擴增Star-F引物序列為AGTCATCACCCATGAGCTGG；Star-R引物序列為TTCAGCTCTGATGACACCGC。內參基因選用在大鼠各組織、細胞中表達相對恒定的18SRNA基因，18S-F引物序列：GAAACGGCTACCACATCC；18S-R引物序列：ACCAGACTTGCCCTCCA。

選用25 μL qRT-PCR體系，每個體系中加入1 μL cDNA，12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTMII，上游和下游引物各1.0 μL，ROX reference dye 0.5 μL和水9 μL。每個樣本設4個平行。采用Bio-Rad公司IQ5實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應條件為：95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40個循環；繪制溶解曲線，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，0.3 ℃/s。

相同條件下，內參18S基因和Star基因在不同的管內擴增，反應結束后，軟件自動導出擴增動力學曲線，溶解曲線和CT值，通過溶解曲線來判定RCR反應的特異性，根據熒光曲線的CT值分析計算得出定量結果。

1.2.3 STAR蛋白酶聯免疫分析 取出冷凍保存的睪丸組織，融化后仍然保持2～8 ℃。用預冷的PBS沖洗去除組織表面殘留血液和雜質，剪刀剪碎組織稱重，按1 g組織加入預冷的9 mL PBS，冰上3 000 r/min勻漿10 s，重復3～5次，3 000 r/min離心20 min，取上清分裝(1 mL)備用。然后按大鼠類固醇合成急性調節蛋白(STAR)酶聯免疫分析試劑盒說明書操作，終止反應后15 min內上酶標儀完成檢測，運用GEN5CHS 2.01軟件分析處理檢測數據，統計記錄檢測結果。

2 結果與分析

2.1 轉基因大豆對大鼠睪丸、附睪臟器系數的影響

解剖觀察大鼠睪丸、附睪形態、顏色正常，大小、器官間比例協調。喂食對應飼料30，60，90 d后計算臟器系數結果顯示，試驗組睪丸、附睪臟器系數略高于或低于對照組，經t檢驗發現，除30 d處理組附睪系數(P<0.05)差異顯著外，其它各處理組間P值均大于0.05，無顯著性差異，見表1。

表1 轉基因大豆對臟器系數的影響?

? *表示試驗組與對照組間差異顯著(P<0.05)。

臟器系數是毒性試驗的常用指標，可以敏感反映受試物對動物臟器的毒性作用，GM組與CK組相比，僅30 d處理組附睪系數(P<0.05)差異顯著，其它各組間差異均不顯著。董延生等[11]研究表明SD大鼠8～12周齡臟器系數正常值參考范圍：睪丸0.566～1.043，附睪0.181～0.349；12～24周齡臟器系數正常值參考范圍：睪丸0.420～0.894，附睪0.169～0.366。飼喂試驗飼料30 d后，大鼠處于8～12周齡期間，飼喂試驗飼料60，90 d后，大鼠處于12～24周齡期間，分析試驗所得臟器系數數據，所測結果全部處于正常值范圍內，30 d處理組附睪系數差異顯著可能是由動物個體差異造成的，且轉基因大豆并未造成睪丸與附睪的增生、水腫、充血或萎縮等退行性改變。研究結果與蘆春斌等[12]喂食轉基因大豆對子代雄鼠睪丸臟器系數影響一致。

2.2 轉基因大豆對大鼠睪丸StAR mRNA水平表達的影響

用RT-PCR方法測定大鼠相關基因的表達量，由圖1可知，擴增曲線光滑平穩，基線平整沒有引物二聚體產生，指數區較明顯，由于多種原因影響擴增后期曲線分散，基本呈S型，符合測定要求。

RT-PCR完成后根據記錄數據，在相同模板下，用擴增目的基因的CT值減去內參基因的CT值，得到目的基因的相對表達量ΔCT值，即StAR目的基因相對于內參基因18SRNA的表達量。分別計算30，60，90 d轉基因飼料飼喂大鼠(GM組)和非轉基因飼料飼喂大鼠(CK組)的StAR目的基因、內參基因的CT值和StAR目的基因的相對表達量，具體ΔCT值見表2。

由表2可知，大鼠內參基因18SRNA基因表達CT數值個體間有所差異，但表達量相對穩定，內參基因表達個體間差異不顯著，說明內參基因選擇合理。飼喂試驗飼料30 d后，試驗大鼠進入性成熟期，不同處理時間組內大鼠StAR 基因相對表達量有所變化，但同組內30 d/60 d、30 d/90 d、60 d/90 d基因表達t檢驗P值均大于0.05，表明性成熟期組內大鼠StAR 基因表達未受時間影響，差異不顯著，統計分析結果見表3。

通過計算得30，60，90 d飼喂轉基因飼料組和非飼喂轉基因飼料組StAR 基因相對表達量的平均值分別為5.037±0.597，3.963±0.323，4.353±0.648，4.29±0.233，4.757±0.269，5.337±0.579。運用方差分析兩組大鼠StAR 基因相對表達量，經t檢驗，P值分別為0.175，0.556，0.185，均大于0.05，不同處理時間GM組與CK組StAR 基因表達差異不顯著，見圖2。表明試驗大鼠StAR 基因表達未受飼料成分調節影響。

圖1 熒光定量擴增曲線

處理時間/d項目GM組CK組目的基因CT值26.1125.9625.8426.4826.1526.2530內參基因CT值21.8320.8720.1021.8821.9222.21ΔCT值4.285.095.744.604.234.04目的基因CT值24.9625.1523.9124.7524.7124.1460內參基因CT值20.5621.5220.0519.7619.8119.76ΔCT值4.403.633.864.994.904.38目的基因CT值27.0226.9626.9627.5627.6627.5490內參基因CT值22.9523.2221.7121.7721.9623.02ΔCT值4.073.745.255.795.704.52

表3 組內大鼠不同處理時間StAR 基因表達量比較

圖2 目的基因相對表達水平

2.3 轉基因大豆對大鼠睪丸StAR蛋白水平表達的影響

記錄酶標儀檢測結果，根據標準品系列數據，運行GEN5CHS 2.01軟件，得到檢測標準曲線(見圖3)，生成R2=1的曲線方程y=Y=A×X+B，其中A=0.007 33，B=-0.051 06。

根據酶標儀檢測結果，依試驗操作換算，結果見圖4，喂食轉基因大豆30，60，90 d后，GM組大鼠睪丸組織中StAR蛋白含量分別為(0.691±0.039)，(0.720±0.013)，(0.987±0.130) ng/g，與CK組StAR蛋白含量(0.758±0.028)，(0.756±0.024)，(0.742±0.094) ng/g相比，t檢驗P值分別為0.118，0.130，0.098，均大于0.05，表明喂食轉基因大豆對大鼠睪丸中StAR蛋白含量無明顯影響。

圖3 StAR檢測標準曲線

圖4 喂食轉基因大豆對大鼠睪丸StAR蛋白含量的影響

睪酮是雄性大鼠的主要性激素，在胚胎發育雄性化、精子生成、雄性性行為激發與維持以及性腺的發育等生理過程中起著重要的作用。睪酮合成在睪丸間質細胞線粒體內膜上進行，而合成原料膽固醇存在于線粒體外，生理條件下膽固醇從線粒體外膜向內膜的轉運需要StAR蛋白作用于線粒體外膜，介導并促進膽固醇的轉運，轉運蛋白StAR在膽固醇轉運中起限速作用[13]。研究表明在飼喂含轉CP4-epsps基因大豆飲料30，60，90 d后，試驗組大鼠睪丸組織中StAR基因mRNA水平的表達與對照組無顯著差異，StAR基因蛋白水平的表達對應組間差異無統計學意義，可見短期喂食含轉基因成份飼料不會影響動物的生長發育及其組織器官的功能。Qi等[4]認為復合性狀轉基因大豆35?423×40-3-2與非轉基因大豆具有同樣的安全性。劉莎莎等[14]也未發現大豆轉基因成分對肉雞生化指標、器官發育、代謝殘留有不良影響，且劉斌等[15]也報道轉基因豆粕對嶗山奶山羊生長性能和肌肉品質無顯著影響。但這類研究有其局限性，如Raffaella等[16]研究發現喂食抗草甘膦大豆的母羊所產的小羊γ-谷氨酰胺轉移酶的水平較高，影響了其肝臟和腎臟的細胞代謝。

3 結論

試驗研究了短期喂食轉CP4-epsps基因大豆對雄性大鼠睪丸StAR表達的影響，結果表明，喂食轉基因大豆未造成雄性大鼠主要生殖器官病理改變，睪丸、附睪生長發育正常；試驗變量對大鼠睪丸間質細胞雄性激素合成過程固醇類原料轉運蛋白表達沒有明顯影響。表明短期飼喂轉CP4-epsps基因大豆對試驗大鼠無毒害作用，但隨著對轉基因喂食動物的深入研究(檢測更多的相關分子)，或更長久地(以年為單位)喂食動物轉基因飼料是否會影響動物的生長發育及其組織器官的功能還有待深入研究。本課題組正在對大鼠雄性激素合成調控的其它關鍵基因表達進行研究，以進一步探討轉基因大豆的食用安全性。

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Effects of short term feeding transgenic soybean on the expression of StAR in rat testis

SHIZong-yongXUDong-meiLUChaoYUANJian-qing

(CollegeofLifeScience,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu,Shanxi030801,China)

The present study was conducted to discuss the effects on genetically modified soybeans on the level of mRNA and protein in StAR gene in male rat, and aimed to provide a scientific basis for the security of transgenic soybeans. Thirty male SD rats were randomly divided into GM group and CK group. The GM group were fed with transgenic Roundup Ready soybean containing CP4-EPSPS gene, and the CK group were fed with non-transgenic soybean. Three rats of every group were killed at 30 d, 60 d and 90 d, respectively. Viscera index (testes and epididymides) was calculated. RT-PCR was used to measure the expression of StAR gene, and ELISA was used to analysis the expression of StAR protein. The morphology and color of testes and epididymides of the GM group and CK group were observed. No significant differences were found in size and testis coefficient. Epididymis coefficient were no significant difference(P>0.05)except 30 d group. The average expression of StAR gene and protein in GM and CK group (30 d 60 d and 90 d) was detected, and no significant differences between the two groups at the same time were found. The results suggested that feeding transgenic soybean for 30 d showed no damages to occurrence of testes and epididymides in rat, and the expression of StAR gene and protein were no difference either.Keywords： GM soybeans; rat; visceral coefficents; StAR

山西省自然科學基金(編號：2013011028-2)；山西省科技攻關基金(編號：20140311025-3)

史宗勇(1970—)，男，山西農業大學副教授，碩士。

E-mail：zongyongtg@sohu.com

2016-03-01

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.003