胃癌組織核受體輔激活蛋白5的表達變化及其臨床意義

劉松杰，閆東紅，徐兵

(新鄉市中心醫院，河南新鄉453000)

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胃癌組織核受體輔激活蛋白5的表達變化及其臨床意義

劉松杰，閆東紅，徐兵

(新鄉市中心醫院，河南新鄉453000)

目的 探討核受體輔激活蛋白5(NCOA5)在胃癌發生、發展中的作用。方法 選擇胃癌患者72例，取其手術切除的胃癌組織及其配對的癌旁正常組織，采用FQ-PCR、Western blotting法檢測NCOA5 mRNA和蛋白表達，分析NCOA5表達與患者臨床病理參數的關系。結果 胃癌組織及癌旁正常組織NCOA5 mRNA表達下調率分別為80.6%(58/72)、16.7%(12/72)；NCOA5蛋白表達缺失率分別為75.0%(54/72)、13.9%(10/72)，二者比較P均<0.05。胃癌組織NCOA5 mRNA表達下調及NCOA5蛋白表達缺失與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、遠處轉移均無關(P均>0.05)，與腫瘤組織分化程度、TNM分期均有關(P均<0.05)；胃癌組織NCOA5 mRNA表達下調與淋巴結轉移有關(P<0.05)，而NCOA5蛋白表達缺失與淋巴結轉移無關(P>0.05)。結論 NCOA5低表達可能促進胃癌的發生、發展。

胃癌；核受體輔激活蛋白5；臨床病理參數

胃癌的發生、發展是一個多因素、多階段逐步演化的過程，涉及多種抑癌基因的失活和原癌基因的激活[1，2]。核受體輔激活蛋白5(NCOA5)是新發現的抑癌基因，是由579個氨基酸組成的核受體輔助調節因子。最新研究表明，NCOA5基因缺失與肝癌的發生有關[3，4]；但NCOA5與胃癌的關系鮮見報道。為此，我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2010年1月～2016年1月我院收治的72例胃癌患者，男46例、女26例，年齡(58.2±4.5)歲(<60歲40例、≥60歲32例)。72例患者均行手術治療，術前未接受放療、化療或其他抗癌治療。腫瘤位于胃食管連接部(發生于胃食管連接部近端5 cm和遠端5 cm之間)28例，胃部[5]44例；腫瘤直徑(3.6±0.3)cm(<3 cm 20例、≥3 cm 52例)；組織分化程度：高、中分化30例，低、未分化42例；TNM分期(采用2010年國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會分期標準[6])：Ⅰ、Ⅱ期29例，Ⅲ、Ⅳ期43例；淋巴結轉移45例，遠處轉移12例。

1.2 胃癌組織及癌旁正常組織NCOA5表達檢測 取手術切除的胃癌組織及其配對的癌旁正常組織(距癌組織≥2 cm)，離體后立即置于滅活RNA酶的凍存管中液氮冷凍，-80 ℃低溫冰箱凍存。①NCOA5 mRNA表達檢測：采用FQ-PCR技術。取胃癌組織及癌旁正常組織各50～100 mg，采用TRIzol法提取總RNA。取總RNA 2 μg，按RT Easy TM Ⅰ試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。根據Real Time PCR Easy TM-SYBR Green Ⅰ試劑盒說明書配備反應體系，以β-actin作為內參，進行熒光定量PCR擴增，每個樣本設置3個復孔。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40個循環。以2-ΔΔCT法計算NCOA5 mRNA相對表達量。NCOA5 mRNA相對表達量≥1為表達上調，<1為表達下調[7]。②NCOA5蛋白表達檢測：采用Western blotting法。取胃癌組織及癌旁正常組織各50 mg，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BSA法繪制蛋白濃度標準曲線，測定提取的蛋白濃度，并將提取的蛋白與SDS上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min。配制10% SDS-聚丙烯酰胺分離膠和5% SDS-聚丙烯酰胺濃縮膠，電泳槽中加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，每個泳道加入20 μg蛋白。電泳2 h，以濕轉法將蛋白轉印于聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原，加入NCOA5山羊抗人多克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃過夜。次日洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG二抗(1∶3 000稀釋)，室溫搖床上孵育1 h，增強型化學發光試劑孵育5 min，曝光成像，采用Adobe Photoshop CS5分析其圖像灰度值。NCOA5蛋白的表達用β-actin蛋白的表達量來校正。以NCOA5基因的灰度值與β-actin基因的灰度值之比為相互比較的參數，以癌旁正常組織的平均值為標準，大于及在此范圍內為蛋白表達，未出現條帶及低于正常范圍為蛋白表達缺失[8]。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計數資料以百分率表示，結果比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織NCOA5 mRNA和蛋白表達比較 胃癌組織NCOA5 mRNA表達下調率為80.6%(58/72)，癌旁正常組織為16.7%(12/72)，二者比較P<0.05。胃癌組織NCOA5蛋白表達缺失率為75.0%(54/72)，癌旁正常組織為13.9%(10/72)，二者比較P<0.05。

2.2 胃癌組織NCOA5表達與患者臨床病理參數的關系 胃癌組織及癌旁正常組織NCOA5 mRNA和蛋白表達具有一致性，即胃癌組織NCOA5呈低表達，其與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、淋巴結轉移均無關(P均>0.05)，而與腫瘤組織分化程度及TNM分期均有關(P均<0.05)。見表1。

表1 胃癌組織NCOA5表達與患者臨床病理參數的關系

3 討論

腫瘤標志物可反映腫瘤的生物學特征，對腫瘤的診斷、治療及預后具有重要意義。如胃癌的腫瘤標志物——AFP、CEA、CA19-9等已成為近年來研究的熱點[9，10]。

NCOA5是由579個氨基酸組成的核受體輔助調節因子，位于人染色體20q13.12，也是雌激素α、β受體和孤核激素受體BD73的輔激活蛋白[3，11]。有研究發現，NCOA5基因缺陷可誘發雄性小鼠原發性肝癌，又能導致小鼠糖耐量減低。炎癥是2型糖尿病和肝細胞癌的共同致病基礎，其中IL-6是較為常見的致病因子，盡管IL-6在胰島素抵抗中的作用已被發現，但一些研究表明，IL-6表達增加對胰島素作用的影響具有高度組織特異性并依賴其生理狀態，如小鼠處于運動狀態時骨骼肌釋放的IL-6能改善胰島素的敏感性，而IL-6的表達缺失可增加胰島素抵抗。此外，肝臟中IL-6的表達增加能引起慢性炎癥，導致胰島素抵抗和肝細胞癌的發生，同時阻止IL-6的過表達可限制部分原發性肝癌的發生、發展，尤其在胰島素抵抗的早期、肝臟脂肪變性和結構異常時；IL-6-STAT3信號通路的異常激活可能是導致小鼠和人肝細胞癌發生的重要因素[3，12,13]。有研究表明，雌激素信號是2型糖尿病和肝細胞癌發生的另一條重要調節通路，雌激素和雌激素α受體(ERα)能夠調節炎癥因子表達、葡萄糖和脂質穩態及胰島β細胞生存，故能對2型糖尿病和肝細胞癌提供保護作用，ERα亦能像其他轉錄因子一樣通過輔激活因子和輔阻遏因子調節基因轉錄。研究還發現，NCOA5可能與TNF-α、NF-κB有關，如TNF-α在NCOA5基因缺陷的動物組織中表達顯著升高，但這種基因缺陷能否被逆轉及其在人體中的具體作用機制尚不十分清楚[14～17]。

本研究結果顯示，胃癌組織NCOA5 mRNA表達下調率、NCOA5蛋白表達缺失率均高于癌旁正常組織。說明在胃癌組織中NCOA5呈低表達，在癌旁正常組織中呈高表達，故認為NCOA5可能是胃癌的一種抑癌基因。本研究還發現，胃癌組織NCOA5 mRNA表達下調及NCOA5蛋白表達缺失與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、遠處轉移均無關，與腫瘤組織分化程度、TNM分期均有關；胃癌組織NCOA5 mRNA表達下調與淋巴結轉移有關，而NCOA5蛋白表達缺失與淋巴結轉移無關。提示NCOA5低表達可促進胃癌細胞的增殖、分化，而上皮間質轉化 (EMT) 通常被認為是腫瘤浸潤和轉移的前提，因此推測NCOA5可能參與了EMT過程，進而促進胃癌細胞的侵襲和轉移。

總之，我們認為NCOA5低表達可能促進胃癌的發生及發展。

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