先天性巨結腸病變腸段CAD、S-100蛋白表達及其臨床意義

符策君，張小波，李權

(海南省人民醫院，海口570311)

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先天性巨結腸病變腸段CAD、S-100蛋白表達及其臨床意義

符策君，張小波，李權

(海南省人民醫院，海口570311)

目的 探討組織蛋白酶D(CAD)、S-100蛋白在先天性巨結腸(HD)發生、發展中的作用及其作用機制。方法 選擇HD患兒41例(HD組)，分別取病變腸段的狹窄段、移行段、擴張段；另取10例因腸穿孔或腸梗阻行結腸造瘺術患兒的病變結腸組織(對照組)。免疫組化染色后，觀察兩組病變腸段CAD、S-100蛋白陽性表達，并比較兩組肌間神經從、成熟神經節細胞數量。結果 HD組狹窄段和移行段CAD陽性表達率明顯低于對照組，移行段和擴張段S-100蛋白陽性表達率明顯低于對照組(P均<0.05)。對照組神經纖維、神經膠質細胞可見S-100蛋白陽性表達，而神經節細胞未見S-100蛋白陽性表達；神經節細胞可見CAD陽性表達，細胞形態規則，核仁明顯；另有少量細胞形態不規則，缺乏核仁。HD組各段肌間神經叢、成熟神經節細胞數明顯低于對照組(P均<0.05)。結論 CAD、S-100蛋白表達降低可促進HD的發生、發展；其機制可能與病變腸段神經節及間質神經纖維數量減少有關。

先天性巨結腸；組織蛋白酶D；S-100蛋白

先天性巨結腸(HD)是由于結腸黏膜及黏膜下括約肌神經叢缺乏神經節細胞或神經節細胞功能減退，導致腸管持續痙攣，糞便淤滯于近端結腸，繼而近端結腸肥厚、擴張，是小兒常見的先天性腸道疾病之一[1，2]。其病因及發病機制目前尚未完全清楚[3]。一般認為，細胞外基質異常表達及神經節脊細胞的無功能遷移可能是導致HD的主要原因。有研究發現，組織蛋白酶D(CAD)和S-100蛋白可誘導細胞外基質的分化不良，導致神經節細胞的功能異常[4]。本研究探討CAD和S-100蛋白在HD發生、發展中的作用。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2007年2月～2015年5月我院收治的HD患兒41例(HD組)，男28例、女13例，年齡5個月～4歲、平均1.52歲，體質量4.5～18.7 kg、平均11.8 kg，身高51.4～120.6 cm、平均71.3 cm，均為足月兒。均經X線鋇灌腸、直腸黏膜活檢等檢查明確診斷。排除合并其他消化道畸形。41例患兒均行巨結腸根治術。術中每例患兒切除腸管17～31 cm、平均25.0 cm，其中狹窄段平均10.24 cm、移行段平均5.01 cm、擴張段平均7.82 cm。對照組為10例同期因腸穿孔或腸梗阻行結腸造瘺術患兒，男7例、女3例，年齡5個月～4歲、平均1.47歲，體質量4.7～17.9 kg、平均11.6 kg，身高51.3～118.6 cm、平均73.1 cm，均為足月兒。術中取其病變結腸組織。兩組性別、年齡、體質量、身高等具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，患兒家屬均知情同意。

1.2 相關指標觀察

1.2.1 病變結腸組織CAD、S-100蛋白表達 采用免疫組化染色法。取兩組手術切除的結腸組織標本(HD組分別取狹窄段、移行段、擴張段腸組織)，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖新，PBS浸泡5 min，3% H2O2室溫孵育5 min，去離子水沖洗3 min×3次；10%牛奶蛋白(1 g蛋白+100 mL純水)封閉，室溫孵育5 min，滴加CAD或S-100蛋白抗體(鼠來源)，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗5 min×3次；滴加HRP標記的二抗(兔來源)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加NBT/BCIP顯色劑顯色5 min，復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下拍照觀察。結果判定：CAD陽性染色定位于神經節細胞胞質，呈棕黃色顆粒。S-100蛋白陽性染色定位于神經纖維細胞，呈棕黃色顆粒。隨機取一張切片，低倍鏡(×100)下計數陽性染色細胞及細胞總數，陽性細胞所占比例<25%為陰性，≥25%～<50%為弱陽性，≥50%～<75%為陽性，≥75%為強陽性。陽性細胞所占比例≥25%即為陽性表達。

1.2.2 腸壁肌間神經叢及成熟神經節細胞數量 每張S-100蛋白染色切片于低倍鏡(×100)下隨機選取10個視野，觀察肌間神經叢數。每張CAD染色切片于高倍鏡(×400)下隨機選取20個肌間神經叢，觀察叢內神經節細胞數，區分成熟和未成熟神經節細胞(細胞形態規則、有明顯核仁即可判斷為成熟神經節細胞)。

2 結果

2.1 兩組結腸組織CAD、S-100蛋白陽性表達比較 見表1。對照組神經纖維、神經膠質細胞S-100蛋白陽性表達，而神經節細胞未見S-100蛋白陽性表達，黏膜下、肌間可有大量深染的神經叢，尤以肌間最多，叢內有典型的細胞狀“空白”區。神經節細胞CAD陽性表達，細胞形態規則，核仁明顯，胞質內見棕黃色顆粒，另有少量陽性細胞形態不規則，核仁不明顯。HD組狹窄段神經纖維、神經膠質細胞S-100蛋白陽性表達，鏡下可見神經纖維細胞肥大，染色呈深褐色，神經叢內缺乏典型的細胞狀“空白”區；HD組移行段神經纖維細胞增粗，染色相對較淺，偶可見神經叢內細胞狀“空白”區，但多不典型；HD組擴張段神經纖維細胞形態逐漸恢復正常，染色淺，鏡下可見典型的細胞狀“空白”區。HD組狹窄段肌間神經叢內神經節細胞缺失，未見CAD陽性表達細胞；HD組移行段可見少量CAD陽性表達細胞，多位于黏膜下神經叢內，多數細胞形態偏小、無核仁；HD組擴張段鏡下可見正常腸壁結構，神經叢內神經節細胞胞質呈陽性反應，CAD陽性細胞形態規則、核仁明顯。

表1 兩組CAD、S-100蛋白陽性表達比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組腸壁肌間神經叢及成熟神經節細胞數量比較 見表2。

表2 兩組腸壁肌間神經叢及成熟神經節細胞數量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

HD為一組良性增生性疾病，可導致患兒出現頑固性腹脹、便秘以及腸道營養吸收障礙引起的營養不良性發育遲緩，部分患兒可因腸液大量聚集、腸道正常菌群失調以及部分微生物分泌的細胞外毒素侵襲腸壁，可伴發小腸結腸炎[4]。Swenson或Soave手術為HD的常用術式且療效較好。但楊小進等[5]研究發現，約25%的患兒術后仍然出現明顯的便秘或腹瀉癥狀。尚卿等[6]研究認為，部分HD病灶的殘留及其對周邊正常腸道黏膜下神經叢神經節的慢性侵襲性影響可能是導致其臨床癥狀復發的原因。

CAD主要表達于腦、脊髓等部分神經元細胞，其在神經節細胞核周邊及胞質內的聚集程度可影響神經節細胞的分化成熟程度[7]。S-100蛋白的天冬氨酸殘基末端磷酸化可影響腸道自主神經節的電沖動傳遞。二者可能參與HD的發生、發展，同時其異常表達可為HD診斷提供一定參考。此外，S-100蛋白還可誘導腸道黏膜皺襞中神經節細胞的缺失。有研究證實，在炎癥、自身免疫性疾病、惡性腫瘤等組織中CAD、S-100異常表達，并與患者遠期預后有一定關系[8]。但二者在HD中的研究目前相對較少，且相關研究的樣本量較少、臨床資料偏移較為嚴重。

本研究結果顯示，HD組狹窄段和移行段CAD陽性表達率明顯低于對照組，表明CAD低表達可促進HD的發生、發展；原因可能為CAD表達降低失去了對神經節鞘膜細胞在分化、成熟中保護作用。HD組移行段和擴張段S-100蛋白陽性表達率明顯低于對照組，提示S-100蛋白低表達在促進HD發生過程中可能具有一定作用。但本研究并未發現HD組狹窄段S-100蛋白陽性表達與對照組的差異，可能與樣本量不足、臨床資料納入及檢測方法不統一等有關。本研究還發現，對照組S-100蛋白陽性表達于神經纖維、神經膠質細胞，黏膜下、肌間可有大量深染的神經叢，尤以肌間最多，叢內有典型的細胞狀“空白”區；而神經節細胞可見CAD陽性表達，呈棕黃色顆粒，二者陽性表達定位不同可用于區分神經節細胞和神經纖維細胞[9，10]。進一步分析發現，HD組病變腸段神經纖維細胞肥大，染色呈深褐色，神經叢內缺乏典型的細胞狀“空白”區，提示神經節細胞缺乏的同時往往伴隨明顯的神經纖維增粗等代償性改變。HD組各段肌間神經叢、成熟神經節細胞數明顯低于對照組，表明成熟神經節或神經叢的數目異常可能是導致HD發生的核心因素，但仍需進一步研究證實。提示臨床手術過程中擴大HD病變腸段切除范圍能減少術后便秘或腹瀉的發生[11～16]。

綜上所述，CAD、S-100蛋白表達降低可促進HD的發生、發展；其機制可能與病變腸段神經節及間質神經纖維數量減少有關。

[1] 徐兵，孫傳成，彭燕，等.先天性巨結腸病變腸段CAD、S-100的檢測及意義[J].山東醫藥，2012，52(14)：13-15.

[2] 關鳳玲，孫曉毅，周晟，等.先天性巨結腸癥及其同源病神經標志物的表達以及圖形測量定量研究[J].中華小兒外科雜志，2013，28(7)：358-361.

[3] 趙淑君，李學雄，査戈，等.新疆地區漢族、維吾爾族先天性巨結腸患兒組織蛋白酶D與S-100的表達及其意義[J].新疆醫科大學學報，2012，35(10)：1348-1351.

[4] 陳衛堅，賀新玉，周小漁，等.先天性巨結腸免疫組織化學的表達[J].實用兒科臨床雜志，2006，21(4)：249-250.

[5] 楊小進，林傳友，胡道松，等.外周蛋白和組織蛋白酶D在先天性巨結腸癥中的表達[J].中華小兒外科雜志，2004，25(3)：69-71.

[6] 尚卿，劉遠梅.腸神經嵴干細胞發育與先天性巨結腸關系研究[J].現代醫藥衛生，2015，31(8)：1164-1167.

[7] 陽歷，李帥，湯紹濤，等.改良腹腔鏡輔助Duhamel結腸次全切除術治療長段型先天性巨結腸癥[J].中國微創外科雜志，2015，15(2)：132-135.

[8] 嚴振輝，洪居陸，柳學國，等.先天性巨結腸類緣病與先天性巨結腸的鋇灌腸表現對照分析[J].放射學實踐，2015，30(2)：153-156.

[9] Warren M, Kaul A, Bove K. Calretinin-immunoreactive hypoinnervation in Down syndrome (DS): report of an infant with very short-segment Hirschsprung disease (vsHD) and comparison to biopsy findings in 20 normal infants and 11 infants with DS and chronic constipation[J]. Pediatr Dev Pathol, 2015,19(2):87-93.

[10] 陳衛堅，周小漁，李梨平，等.S-100蛋白與Cathepsin D在先天性巨結腸診斷中的應用[J].中國現代兒科學雜志，2005，2(2)：135-138.

[11] Taguchi T, Ieiri S, Miyoshi K, et al. The incidence and outcome of allied disorders of Hirschsprung′s disease in Japan: results from a nationwide survey[J]. Asian J Surg, 2015,34(5):112-117.

[12] Gao H, Wang D, Zhao X, et al. Relationship of Ghrelin gene polymorphism with congenital anorectal malformation and Hirschsprung disease[J]. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi, 2015,18(7):707-712.

[13] Zhang Z, Jiang Q, Li Q, et al. Genotyping analysis of 3 RET polymorphisms demonstrates low somatic mutation rate in Chinese Hirschsprung disease patients[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(5):5528-5534.

[14] Bae JS, Koh I, Cheong HS, et al. A genome-wide association analysis of chromosomal aberrations and Hirschsprung disease[J]. Transl Res, 2016,24(6):102-106.

[15] Bondurand N, Southard-Smith EM. Mouse models of Hirschsprung disease and other developmental disorders of the enteric nervous system: old and new players[J]. Dev Biol, 2016,22(4):102-104.

[16] Luzón-Toro B, Gui H, Ruiz-Ferrer M, et al. Exome sequencing reveals a high genetic heterogeneity on familial Hirschsprung disease[J]. Sci Rep, 2015(5):90-92.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.027

R574.62

B

1002-266X(2016)40-0080-03

2015-11-25)