PNPLA3基因I148M多態性對肝癌細胞HepG2細胞周期及Cyclin D1、p53表達的影響

韓利蓉，宋江勤，郭飛波

(天門市第一人民醫院，湖北天門431700)

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PNPLA3基因I148M多態性對肝癌細胞HepG2細胞周期及Cyclin D1、p53表達的影響

韓利蓉，宋江勤，郭飛波

(天門市第一人民醫院，湖北天門431700)

目的 探討含patatin樣磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)基因I148M多態性對肝癌細胞HepG2細胞周期及Cyclin D1、p53表達的影響。方法 構建PNPLA3基因I148M突變型(突變組)、PNPLA3基因I148M野生型(野生組)的肝癌細胞HepG2，以空載體細胞作為對照組，采用流式細胞儀檢測各組細胞周期，Western blotting、熒光定量PCR技術檢測各組細胞Cyclin D1、p53蛋白及mRNA表達。結果 突變組G1期細胞所占比例明顯低于野生組和對照組，S、G2/M期細胞所占比例明顯高于野生組和對照組(P均<0.05)；野生組與對照組G1、S、G2/M期細胞所占比例比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。三組間Cyclin D1蛋白及mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，突變組p53蛋白及mRNA相對表達量顯著高于野生組和對照組(P均<0.05)，而野生組和對照組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論 PNPLA3基因I148M多態性能夠誘導p53過表達，導致肝細胞周期紊亂，最終發展成肝癌細胞。

肝癌；含patatin樣磷脂酶域蛋白3；基因多態性；細胞周期；細胞周期蛋白D1；p53

國內外研究均證實，細胞周期阻滯與腫瘤的發生、發展密切相關[1，2]。含patatin樣磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)屬于PNPLA家族成員之一，與傳統激素敏感性脂肪酶相比，PNPLA家族成員N末端均有一個patatin區域，使得其在體內外均具有脂肪合成和分解功能，被認為是調節肝臟脂肪代謝的主要基因之一[3～6]。Rametta等[7]對人類染色體上PNPLA3基因分析發現，I148M多態性位點與肝臟脂肪含量升高有關。Hoekstra等[8]研究亦證實，PNPLA3基因I148M多態性與肝纖維化有關，且是肝癌發生的獨立危險因素。由于脂肪代謝紊亂是多種肝病甚至肝癌的發病基礎，推測PNPLA3基因I148M多態性可能與肝癌的發生、發展有關。2014年7月～2015年4月，我們觀察了PNPLA3基因I148M多態性對人肝癌細胞HepG2細胞周期及Cyclin D1、p53表達的影響。現分析結果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2和PNPLA3基因I148M突變型、PNPLA3基因I148M野生型、空載質粒轉染的腺病毒，均購自上海士鋒生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，購自美國賽默飛世爾科技公司；蛋白裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、SDS-PAGE電泳分離蛋白均購自武漢博士德生物工程有限公司；β-actin抗體、辣根過氧化酶標記的二抗(羊抗鼠IgG抗體)、Cyclin D1單克隆抗體、p53單克隆抗體均購自美國圣克魯斯生物技術公司；Cyclin D1、p53、β-actin引物由美國金斯瑞生物科技有限公司設計。ABI GeneAmp 9700 PCR儀、Odyssey成像系統及圖像分析軟件購自美國LI-COR公司。

1.2 細胞培養及腺病毒轉染 取人肝癌細胞株HepG2置于DMEM培養液中，37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養。培養3天，待細胞融合≥80%時，加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL消化，吸棄舊培養液，PBS洗滌3次，輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，混勻后加入新鮮培養基傳代培養。取第4代對數生長期HepG2細胞，接種于6孔板中，每孔約2×105個，每孔設3個復孔。胰蛋白酶-EDTA消化后，加入RPMI 1640培養液，CO2培養箱中孵育12 h，分別加入含有PNPLA3基因I148M突變型腺病毒(突變組)、PNPLA3基因I148M野生型腺病毒(野生組)和空載質粒轉染的腺病毒(對照組)3×107IU。轉染24 h，加入聚凝胺使培養體系終濃度為6 mg/L，繼續培養48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察并計算細胞轉染效率。以倒置熒光顯微鏡下發現綠色熒光作為轉染成功的標志。

1.3 細胞周期檢測 取對數生長期HepG2細胞，PBS沖洗2次，移液槍吹打成細胞懸液并置于離心管中，室溫下1 000 r/min離心10 min，PBS沖洗5 min×3次；滴加中性乙醇1 mL，4 ℃固定過夜。24 h后，室溫下1 000 r/min離心10 min，PBS沖洗5 min×3次，吹打或細胞成懸液，加入適量碘化丙啶(PI，預先用PBS配制成1 mg/mL)和RNase，使其終濃度為50 mg/L，置于水浴鍋上37 ℃溫浴45 min。采用流式細胞儀檢測細胞周期，每次5×104個細胞。重復檢測3次，取平均值。

1.4 PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白檢測 采用Western blotting技術。取對數生長期HepG2細胞，接種于6孔板，每孔加入含1% PMSF的細胞裂解液100 μL，待細胞完全裂解后，15 000 r/min離心5 min，留取上清液。將上清液移至EP管中，加入等量上樣液，100 ℃煮沸5 min，使蛋白完全變性。SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉移至PVDF膜上，100 mA、40 min電轉后將PVDF膜取出。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶2 000稀釋的PNPLA3單克隆抗體、1∶1 000稀釋的Cyclin D1單克隆抗體和1∶500稀釋的p53單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，加入1∶10 000稀釋的二抗，室溫下震蕩3 h，PBS沖洗3次；熒光圖像掃描及條帶灰度值分析。PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白相對表對量為樣本條帶與β-actin條帶灰度值之比。

1.5 PNPLA3、Cyclin D1、p53 mRNA檢測 采用熒光定量PCR技術。取對數生長期HepG2細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，并逆轉錄成cDNA。PCR擴增：PNPLA3上游引物：5′-CGGAAGACTGTGTCGAGCAA-3′，下游引物：5′-GGATCAAGCGCACTGTGGA-3′；Cyclin D1上游引物：5′-CCGTGTGCTAGCATAGCGC-3′，下游引物：5′-TGCTGGTCAATGTGGCTA-3′；p53上游引物： 5′-GACGTT-

CGGTGTCAGTCTGCC-3′，下游引物：5′-TGGCTGCGACTACATTAGGAC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGCATGCTCGGCTGCGTCT-3′，下游引物：5′-GGTCTGAGGTTCAGCGTTGC-3′。PNPLA3擴增條件：96 ℃預變性1 min，95 ℃變性60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環后72 ℃延伸10 min；Cyclin D1擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個循環后72 ℃延伸5 min。p53擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45個循環后72 ℃延伸5 min。記錄各檢測指標的CT值，重復檢測3次，取平均值。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCT法計算PNPLA3、Cyclin D1、p53 mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 腺病毒轉染HepG2細胞情況 攜帶不同基因型的腺病毒轉染HepG2細胞48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白陽性表達率均高達90%，說明表達目的基因的細胞株構建成功。見插頁Ⅲ圖9。

2.2 各組細胞周期分布比較 見表1。

表1 各組細胞周期分布比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與野生組比較，#P<0.05。

2.3 各組PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白及mRNA表達比較 見表2。

表2 各組PNPLA3、Cyclin D1、p53蛋白及mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與野生組比較，#P<0.05。

3 討論

PNPLA3基因屬于patatin樣磷脂酶家族成員，具有非特異性水解酶的活性。PNPLA3基因多態性與人類非酒精性脂肪肝的遺傳易感性密切相關。近年研究顯示，PNPLA3基因多態性與多種肝臟疾病密切相關，其中I148M位點的多態性與肝臟脂肪含量顯著升高有關[9]。由于這種脂肪升高不受遺傳、體質量、原發病和乙醇攝入的影響，故有學者認為PNPLA3基因I148M多態性可能是導致肝臟病變的主要原因[10]。國外研究證實，PNPLA3基因I148M多態性不僅會增加肝臟脂肪含量，而且與肝臟組織學病變有關[11]。Pirazzi等[12]研究發現，PNPLA3基因I148M多態性與肝纖維化有關，并可能參與了肝細胞癌的發生。關于PNPLA3基因I148M多態性誘導肝臟病變的機制目前尚不清楚，但可以肯定的是與脂肪代謝有關。Burza等[13]研究發現，PNPLA3蛋白能夠水解TG，其I148M位點多態性會導致水解酶的活性喪失，證實I148M多態性可能通過抑制PNPLA3的活性而導致TG分解受阻，而TG蓄積極易導致肝臟脂肪含量增加。對PNPLA3蛋白三維結構解析發現，其148位點氨基酸更換并未改變活性中心和空間結構，而是蛋氨酸的側臂遮蓋了活性中心與底物的結構，從而導致酶對TG水解活性降低[14]。但Valenti等[15]對小鼠PNPLA3基因敲除后并未獲得小鼠脂肪肝模型，也未對小鼠體內TG的代謝造成影響。上述研究結果均提示PNPLA3基因I148M多態性對肝臟病變的影響作用機制較為復雜，需要深入研究。

細胞周期紊亂會導致細胞能量和物質代謝異常，最終引起細胞惡變[16，17]。Romeo等[18]認為，肝癌細胞周期明顯異常，鉑類等抗腫瘤藥物的主要作用機制就是改變腫瘤細胞周期，誘導細胞發生凋亡。細胞周期主要有G1、S、G2、M期，其中G1/S期和G2/M期在維持細胞周期運轉方面最為重要。當細胞通過G1/S期和G2/M期后，則無需依賴外界的分裂信號，能獨立完成細胞周期[19]。因此G1/S期和G2/M期被認為是調控細胞周期的關鍵時期。Cyclin D1、p53均屬于細胞周期調節蛋白，Cyclin D1是由人類CCND1基因所編碼的一類蛋白質，其可通過結合并激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，磷酸化G1期周期抑制蛋白(Rb)，而磷酸化的Rb從其所結合的E2F轉錄因子上解離，從而推動細胞周期由G1期進入到S期。p53基因是細胞生長周期中的負調節因子，與細胞周期的調控、DNA修復、細胞分化、細胞凋亡等生物學功能有關。Cyclin D1、p53是參與調節G1/S期、G2/M期最主要的蛋白，Cyclin D1、p53表達失調與惡性腫瘤的發生、發展密切相關。Valenti等[20]研究證實，肝癌組織Cyclin D1、p53蛋白表達顯著高于癌旁正常組織，隨著治療的好轉，肝癌組織Cyclin D1、p53蛋白表達量逐漸降低。本研究結果顯示，突變組p53 mRNA及蛋白表達量均高于野生組和對照組，提示PNPLA3基因多態性可能通過影響肝癌細胞p53表達，達到調節細胞周期的作用。本研究還發現，突變組G1期細胞所占比例低于野生組和對照組，S、G2/M期細胞所占比例高于野生組和對照組，提示I148M多態性可能與細胞周期紊亂有關。Sookoian等[21]研究證實，肝細胞周期加速后會導致細胞內能量代謝異常，并促進肝癌細胞的生長，且細胞周期的加速與肝癌細胞的惡性程度密切相關。本研究發現，突變組p53 mRNA蛋白相對表達量高于野生組和對照組，而三組細胞Cyclin D1蛋白和mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義，提示PNPLA3基因I148M多態性可能通過上調p53表達而導致細胞周期紊亂，并促使其向肝癌發展。

綜上所述，PNPLA3基因I148M多態性能夠誘導p53過表達，導致肝細胞周期紊亂，最終發展為肝癌細胞。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.019

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