食管癌前病變組織間質成纖維細胞的形態變化及生物學特征

徐志彬，袁麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

(河北醫科大學第四醫院，石家莊050011)

?

食管癌前病變組織間質成纖維細胞的形態變化及生物學特征

徐志彬，袁麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

(河北醫科大學第四醫院，石家莊050011)

目的 觀察食管癌前病變組織間質成纖維細胞(AFs)的形態變化及生物學特征。方法 取食管癌組織、食管癌前病變組織、正常食管組織，采用膠原酶消化法制備食管癌組織間質成纖維細胞(CAFs)、AFs、正常食管組織間質成纖維細胞(NFs)，傳代培養。觀察3種細胞的表面形態，免疫組化染色后觀察其免疫表型[角蛋白(CK)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)]，MTT法檢測細胞增殖情況并繪制細胞生長曲線，流式細胞技術檢測細胞周期。結果 AFs的表面形態介于NFs和CAFs。3種細胞的CK表達均為陰性，Vimentin表達均為陽性。NFs α-SMA表達陰性，AFs、CAFs α-SMA表達均為陽性。AFs的增殖能力及細胞周期各期細胞所占比例亦介于NFs和CAFs。結論 AFs可能是NFs向CAFs轉化的中間過渡階段，其表面結構與生物學特性不同于NFs，與CAFs極其相似。

食管癌前病變；間質成纖維細胞；細胞形態；生物學特征

以往對食管癌的研究主要以癌細胞為基礎，而對癌細胞所處的間質微環境未引起足夠重視。食管癌組織間質成纖維細胞(CAFs)不僅參與食管癌細胞的增殖和侵襲[1～6]，在食管癌的復發和轉移中亦扮演重要角色[7]。食管正常鱗狀上皮向鱗狀細胞癌轉變的過程中有一個中間過渡階段——鱗狀上皮不典型增生階段，而在正常食管組織間質成纖維細胞(NFs)向CAFs轉變的過程中是否也存在不典型增生階段鮮見報道。本研究觀察食管癌前病變組織間質成纖維細胞(AFs)的形態變化及生物學特征。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2015～2016年我院手術切除的食管癌組織、食管癌前病變組織、正常食管組織各10例份。10例食管癌患者術前均未行放化療，術后組織病理檢查證實為低分化鱗狀細胞癌。食管癌前病變組織取自行內鏡下黏膜切除術或黏膜剝離術患者，組織病理檢查證實為高級別上皮內瘤變；正常食管組織取自賁門癌患者癌旁正常鱗狀上皮組織。FBS購自美國Hyclone公司；膠原酶Ⅱ購自美國Gibco公司；二甲基亞砜、四氮唑藍購自美國Sigma公司；鼠抗人角蛋白(CK)單克隆抗體、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體、鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體購自北京西雅金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞培養及鑒定 ①膠原酶Ⅱ消化：將剪好的組織轉移至培養瓶中，加入適量0.1%的膠原酶Ⅱ，于37 ℃ CO2培養箱中消化，直至在顯微鏡下觀察到細胞團或獨立的細胞后終止消化。收集細胞，制備細胞懸液。吸取部分細胞懸液接種于新的培養瓶中，加入適量新鮮培養液，繼續培養，每2～3天換液一次，直到細胞基本爬滿瓶底。②細胞傳代：待細胞基本爬滿瓶底，向培養瓶中加入適量胰蛋白酶-EDTA混合液消化1 min，于倒置顯微鏡下觀察到細胞質回縮、細胞間縫隙增大，終止消化，用吸管反復吹打瓶底，收集細胞。③胰蛋白酶純化：取部分細胞，制備細胞懸液。吸取部分細胞懸液接種于新鮮培養瓶中，加入適量0.25%的胰蛋白酶，顯微鏡下觀察1～2 min，至成纖維細胞變圓、部分脫壁終止消化，用吸管輕輕吹打成纖維細胞生長的區域，收集吹打下來的細胞，常規傳代培養。④細胞凍存與復蘇：取對數生長期細胞進行消化，并收集于離心管中，取新鮮配制的細胞凍存液，逐滴加入離心管中，用吸管輕輕吹打，使細胞均勻，細胞密度為(3～4)×106個/mL。將細胞分裝于塑料凍存管。將凍存管置于4 ℃冰箱2 h，轉入-20 ℃冰箱4 h，再轉入-80 ℃冰箱保存。實驗前取出凍存管，迅速放入37 ℃水浴鍋中，1 min內使其完全融化，取出細胞，離心棄上清，加入新的培養基，接種于培養瓶中，置于溫箱中培養，次日換液。

1.3 細胞形態觀察 將純化后的貼壁細胞直接置于倒置顯微鏡下，觀察細胞大體形態。取純化后的第3代細胞制作細胞爬片，孵育1～2天。鏡下觀察細胞基本爬滿后，常規清洗，95%乙醇固定20 min，晾干，4 ℃保存備用。將制作好的細胞爬片固定于載玻片上，向細胞爬片滴加1 mL瑞氏-吉姆薩染液，2 min后觀察到有細胞著色，棄去染液，用D-Hanks液清洗干凈，光鏡下觀察細胞著色情況。收集純化后的第4代細胞，取細胞(1～2)×107個，常規消化洗滌后，轉入1.5 mL離心管中，1 500 r/min離心8 min，用吸管輕輕吸取上清液，沿離心管側壁輕輕加入2.5%戊二醛固定液1 mL，置于4 ℃冰箱固定4 h，磷酸鹽緩沖液清洗15 min×3次，1%四氧化鋨1～2 h，4 ℃冰箱保存。磷酸鹽緩沖液清洗15 min×3次，梯度丙酮脫水，100%丙酮∶包埋液=1∶3 37 ℃過夜，用包埋劑將樣品包埋在膠囊或包埋板里，置入烤箱，37 ℃ 24 h，然后用超薄切片機將樣品切成厚約50 nm的切片，醋酸雙氧鈾染色30～45 min，檸檬酸鉛染色5～30 min，透射電鏡下觀察細胞形態。

1.4 細胞免疫表型鑒定 如上制作細胞爬片，并將其固定于載玻片上，3% H2O2室溫孵育10 min，PBS液漂洗5 min×3次，用含10%牛血清封閉液封閉30 min，棄去封閉液，加入一抗(CK或Vimentin或α-SMA)，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，滴加二抗，濕盒中孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色，室溫反應10 min，蒸餾水漂洗1 min×2次，蘇木素復染1 min，自來水洗10 min，95%乙醇脫水1～2 s，中性樹膠封片，光鏡下觀察CK、Vimentin、α-SMA表達。

1.5 細胞生物學特征檢測

1.5.1 細胞生長情況 采用四氮唑藍比色法(MTT法)。取NFs、AFs、CAFs各4×103個，分別接種于96孔板中，每孔200 μL。每隔24 h向其中3孔加入MTT液10 μL，繼續培養4 h終止培養，其余各孔繼續培養，每日測3孔，連續測7天。設立與實驗孔條件平行的空白孔，以空白孔調零，選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的吸光度(A)值。

1.5.2 細胞周期 采用流式細胞術檢測。取對數生長期的NFs、AFs、CAFs，接種于6孔板中，細胞密度為4×105個/孔，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每組設3個復孔。培養48 h，收集細胞，并調整細胞密度為1×107個/mL，取100 μL細胞懸液加入DNA染液(PI 50 μg/mL，RNA 酶10 μg/mL及1% Triton-X100 1 mL)，4 ℃冰箱中染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。試驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 三種細胞形態變化 大體形態可見，NFs、AFs、CAFs培養2～3天即可見細胞貼壁，7天左右細胞生長迅速，20天左右即可爬滿瓶底。首次傳代與純化后細胞生長較慢，7天左右才能爬滿瓶底，細胞大部分為成纖維細胞，呈反射狀或柵欄狀生長，期間亦有上皮樣細胞生長。以后每次傳代與純化后，細胞生長較快，2～3天即可爬滿瓶底，混雜的上皮樣細胞越來越少，第4代的成纖維細胞純度即可達95%。凍存的成纖維細胞復蘇后存活率高，生長狀態良好，形態無變化。NFs：細胞間差異小，大小、形狀基本一致，呈扁平長梭形，細胞間界限清楚，單層生長，存在密度抑制和接觸抑制。AFs：大小、形狀基本一致，排列不整，局部出現重疊生長的現象。CAFs：大小、形狀不一，突起多少不定，生長密集雜亂，重疊生長，密度抑制和接觸抑制消失。

光鏡下可見，細胞核呈深紫色，細胞質呈淡粉色。NFs：形態規則，胞質染色均勻，橢圓形，位于胞質中央。AFs：形態不規則，胞質均勻，核大，部分胞核形狀不規則。CAFs：形態不規則，胞質染色淡，胞核大，圓形，核仁明顯。見插頁Ⅱ圖6。

透射電鏡下可見，NFs：胞核形態規則，核大，居中，可見核糖體、高爾基體和內質網，胞質內可見散在微絲。AFs：胞核大而明顯，細胞器發達，微絲呈片狀分布，出現附著斑。CAFs：核大，形態不規則，切跡明顯，核仁明顯，胞質伸展，突起較多，胞質內細胞器發達，可見豐富的核糖體、高爾基體，粗面內質網擴張，微絲密布，局部形成微絲束，成團形成附著斑，可見大量微絲和致密斑。見插頁Ⅱ圖7。

2.2 細胞免疫表型 NFs、AFs、CAFs CK表達均陰性，Vimentin表達均陽性。NFs α-SMA表達陰性，AFs、CAFs α-SMA表達均陽性。

2.3 細胞生物學特征 NFs、AFs和CAFs均呈“S”形生長曲線，3～5天為對數生長期，細胞生長旺盛，AFs的增殖能力介于NFs和CAFs。見表1。CAFs S期、G0/G1細胞比例分別為(33.41±1.65)%、(37.96±2.02)%，AFs分別為(32.83±1.47)%、(45.43±2.91)%，NFs分別為(23.74±1.03)%、(51.46±3.74)%。AFs細胞周期各期細胞所占比例亦介于NFs和CAFs(P均<0.05)。

表1 三種細胞不同時間細胞增殖情況±s)

3 討論

從正常組織到癌前病變，再進展至癌組織是一個漫長的病理過程，期間不僅瘤體內部的變化非常復雜，癌細胞所處的間質微環境在癌團的刺激下亦在變化，以適應癌團的生長、浸潤和轉移。成纖維細胞是間質微環境的主要成分，可分泌多種細胞因子和生長因子，其功能的活躍狀態取決于其是否發生活化[8]。從NFs發展到活化的CAFs是否存在過渡階段——AFs，AFs是否已先于CAFs發生活化，以及是否進一步轉化為CAFs，目前鮮見報道。

曾偉偉等[9]研究發現，在食管癌前病變組織中不僅上皮組織發生了異常，相應間質組織中也出現了活化的間質成纖維細胞，這些表型活化的成纖維細胞在蛋白分泌功能上也存在差別。本研究結果顯示，NFs、AFs、CAFs在細胞表面形態上無明顯差別及特異性表現，但在內部結構的觀察中發現：AFs與CAFs形態不規則，胞突多，細胞器發達，核糖體、內質網和高爾基體處于活躍狀態，同時表現了一些特性，如出現大量附著斑及排列紊亂的微絲。NFs生長到一定密度后存在接觸抑制現象，但AFs與CAFs不存在密度抑制和接觸抑制現象，可重疊生長，這一點與NFs明顯不同。CAFs是一組含有平滑肌肌動蛋白的成纖維細胞，在形態及生物學行為上同時具有平滑肌細胞和成纖維細胞的雙重特性。α-SMA是由肌上皮細胞表達的一種細胞骨架蛋白，是肌成纖維細胞收縮表型的典型標志。本研究CAFs CK陰性、Vimentin陽性、α-SMA陽性，屬VA型，與劉伯新等[10]研究結果一致；而AFs的免疫表型與CAFs的免疫表型相同，亦屬VA型。關于AFs培養鑒定的報道較少，國內僅見孫艷等[11]對乳腺癌前病變成纖維細胞進行過鑒定。本研究中，NFs、AFs和CAFs CK表達均陰性，Vimentin表達均陽性，而AFs和CAFs α-SMA均陽性，說明AFs和CAFs均保留了成纖維細胞的特征，同時兼具平滑肌細胞的特征。

有研究認為，CAFs可與癌細胞相互作用[12～14]，CAFs通過分泌EGF、TGF-β、IGF等細胞因子到細胞外基質，從而促進癌細胞增殖；反之，癌細胞分泌TGF-β1和HGF等因子可刺激癌相關纖維母細胞增殖。本研究發現，NFs增殖緩慢，細胞多停留在G1期；NFs、AFs和CAFs的S期所占百分比依次增高，CAFs在惡性上皮細胞刺激下，增殖明顯加快，S期細胞所占比例最高；AFs增殖能力介于NFs和CAFs，這一結果預示正常食管鱗狀上皮細胞、不典型增生上皮細胞和癌細胞對其鄰近的成纖維細胞產生的作用是有差別的。

綜上所述，AFs可能是NFs向CAFs轉化的中間過渡階段，其免疫表型和生物學特征更接近于CAFs。

[1] 林靖雯，陳謙明，李勝富,等.口腔癌相關成纖維細胞對舌癌細胞株增殖活性的影響[J].四川大學學報(醫學版),2018，39(2)：184-187.

[2] 單麗輝，張思，翟麗麗，等.癌相關纖維母細胞對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲活性的影響[J].實用腫瘤學雜志，2012，26(2)：97-101.

[3] 李薯霞,于世鳳.口腔黏膜成纖維細胞對口腔癌細胞生長影響的研究[J].中國實用口腔科雜志，2009，2(3)：150-152.

[4] Taddei ML, Giannoni E, Comito G, et al. Microenvironment and tumor cell plasticity: an easy way out[J]. Cancer Lett, 2013,341(1):80-96.

[5] Ren J, Guo H, Wu H, et al. GPER in CAFs regulates hypoxia-driven breast cancer invasion in a CTGF-dependent manner[J]. Oncol Rep, 2015,33(4):1923-1937.

[6] Gonzalez-Zubeldia I, Dotor J, Redrado M, et al. Co-migration of colon cancer cells and CAFs induced by TGF-β1enhances liver metastasis[J]. Cell Tissue Res, 2015,359(3):829-839.

[7] Catalano V, Turdo A, Di Franco S, et al. Tumor and its microenvironment: a synergistic interplay[J]. Semin Cancer Biol, 2013,23(6 Pt B):522-532.

[8] 王瑞芬,黃坊,孫和國,等.α-SMA和MMP-9在乳腺癌中的表達及意義[J].診斷病理學雜志，2013，20(2)：91-93.

[9] 曾偉偉,吳明利,徐志彬,等.食管鱗狀上皮癌變過程中間質纖維母細胞的平滑肌肌動蛋白α和CD34表達及意義[J].臨床薈萃,2011,26(22)：1955-1957.

[10] 劉伯新,張羽捷.食管鱗癌TGF-β1和平滑肌肌動蛋白的表達及臨床意義[J].延邊醫學，2014，16(5)：30-32.

[11] 孫艷,彭瓊樂,王黎陽,等.乳腺癌前病變組織原代成纖維細胞生物學特征初步研究[J].第三軍醫大學學報，2012，34(1)：16-19.

[12] Ostman A, Augsten M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth-bystanders turning into key players[J]. Curr Opin Genet Dev, 2009,19(1):67-73.

[13] Grugan KD, Miller CG, Yao Y, et al. Fibroblast-secreted hepatocyte growth factor plays a functio nal role in esophageal aquamous cell carcinoma invasion[J]. Proc Nati Acad Sci U S A, 2010,107(24):11026-11031.

[14] 臧茹琨，宋軼鵬，胡立寬，等.食管鱗狀細胞癌中HGF表達與腫瘤血管形成的關系[J].臨床與實驗病理學雜志，2011，27(11)：1189-1193.

河北省醫學科學研究重點課題計劃(20160656)。

吳明利(E-mail： xzblxh@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.009

R735.1

A

1002-266X(2016)40-0032-03

2015-10-23)