改進植物油黃曲霉毒素B1測定的前處理方法

鄧云 周新華

（茂名市食品藥品檢驗所，廣東茂名 525000）

改進植物油黃曲霉毒素B1測定的前處理方法

鄧云 周新華

（茂名市食品藥品檢驗所，廣東茂名 525000）

黃曲霉毒素B1在自然界廣泛存在，具有強烈的致癌性，其是黃色曲霉菌（Aspergillus flavus）或寄生曲霉菌（Aspergillus parasiticus）的主要次生代謝產物，是目前已知的自然物質中致癌性最強的一種。黃曲霉毒素B1毒性劇烈，致癌性強，即使含量非常少，通過生物積累，也能引起人體器官癌變，所以國內外對其限量標準以及檢驗方法都做了嚴格和深入的研究，但是常用的檢驗前處理方法步驟繁瑣，費時費人力，消耗大量的試劑，且靈敏度低。通過嘗試利用恒溫振蕩器和特制的塑料振蕩架進行植物油的前處理，用酶聯免疫方法對樣品中黃曲霉毒素B1進行檢測，大大提高了檢驗速度、檢出限，降低了成本，對于一般的樣品可加提取液直接測定，具有很高的靈敏度。

植物油 黃曲霉毒素B1 前處理

黃曲霉毒素是一類真菌（如黃曲霉和寄生曲霉）的有毒的代謝產物，它們具有很強的致癌性，主要存在于谷物、堅果、棉籽以及一些和人類血液，動物飼料相關的產品中。其中黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性、致癌性、污染頻率均居于首位。而使用黃曲霉毒素B1 ELISA試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中黃曲霉毒素B1殘留。參考國家標GB/T5009.22-2003。黃曲霉毒素B1檢測試劑盒是應用ELISA技術研發的新一代真菌毒素檢測產品，相比起薄層層析法操作時間短于60min，能最大限度地減少操作誤差和工作強度，提高了試驗靈敏度，且安全無污染。

1　試驗材料與方法

1.1主要材料

板式酶標儀；恒溫孵育箱；梨形分液漏斗（250ml）；恒溫振蕩器；特制20孔振搖架，50ul-1000ul移液槍。

1.2主要試劑

石油醚（分析純，沸點60-90）；1+1甲醇水；ELISA定量檢測試劑盒（蘇菲內含AFB1抗原包被12孔x2條形戴康酶標板；抗原稀釋液；抗原；樣品稀釋液；顯色液ab；終止液；洗液；標準液。

1.3操作步驟

1.3.1前處理步驟

（1）梨形分液漏斗涂好凡士林，編號，稱取5g左右樣品于梨形分液漏斗中。

（2）分別加入20ml石油醚和25ml1+1甲醇水溶液。

（3）用適宜的膠塞緊塞梨形分液漏斗，按順序倒立于特制的20孔振蕩架（剛好可以固定梨形分液漏斗）中，再把振蕩架嫁置于恒溫振蕩器上。

（4）打開恒溫振蕩器電源開關和振蕩開關，調好左右搖晃的速度，振搖15分鐘左右。

（5）取下分液漏斗膠塞，靜置片刻后，扭到活塞，放下下層的甲醇水溶液于一次性杯內。

（6）用移液槍按樣品順序分別移取300ul樣品液于10ml安培瓶內，再加入900ul樣品稀釋液于樣品液內搖勻備用。

1.3.2試劑盒處理步驟

（1）將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

（2）取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2～8℃，不要冷凍。

（3）洗滌工作液在使用前也需回溫，且按20：1的配比配制洗液。（4）編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號。

（5）加標準品/樣本：在標準孔內加入從低到高濃度的標準液各50ul，再在樣品孔加入樣品液50ul后，再加入AFB1抗原試劑50ul/孔，輕輕振蕩混勻，放置入恒溫孵育箱內孵育30min。

（6）洗板：小心拿出反應板，將孔內液體用力甩干，吸取洗滌工作液250ul/孔，充分洗滌4次，每次間隔2分鐘，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

（7）顯色：加入底物液A液50ull/孔，再加底物液B液50ul/孔，輕輕振蕩混勻，再放置恒溫孵育箱避光環境反應15～20min。

（8）終止反應：加入終止液50ul，搖勻。

（9）測定：設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據），測定每孔OD值。（若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定）。

2　結果與討論

2.1結果計算

以酶標儀測出的OD相對值為Y軸，輸入酶標儀計算原件內，并編輯好稀釋倍數以及標準曲線濃度，用對照標準曲線圖，得出樣品的AFB1的lgX值，求出X值，及為樣品中AFB1含量。

2.2結果驗證

用液相色譜法處理同一樣品，與本法得出的實驗結果不大。

3　操作注意事項

（1）室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

（2）在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

（3）每加一種試劑前需將其搖勻。

（4）反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

（5）不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

（6）保存試劑盒于2～8℃，不要冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

（7）試劑變質的跡象，發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm＜0.5）時，表示試劑可能變質。

（8）在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時間為15～20min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到30min（或更長）。反之，則減短反應時間。

（9）濃縮洗滌液如有結晶屬正常現象，請加熱溶解后使用。

（10）該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

4　結語

國標植物油中黃曲霉毒素B1的測定前處理方法繁瑣，耗時長，而且要每個樣品需要搖蕩5分鐘，費人力。通過對其前處理方法進行改進，在操作過程中利用恒溫振蕩器和特質的震搖架從而可以批量處理樣品，進而用酶聯免疫方法對其測定，大大縮短了實驗時間。

鄧云（1987—），男，廣東茂名人，畢業于廣東石油化工學院，研究方向：食品檢測。