全酶解法提取杜仲葉中綠原酸及其含量測定

張雪梅，謝金芮，陳玉甫，張學俊*

（1.貴州大學貴州省發酵工程及生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學藥學院，貴州貴陽550025）

全酶解法提取杜仲葉中綠原酸及其含量測定

張雪梅1，2，謝金芮3，陳玉甫1，2，張學俊1，2*

（1.貴州大學貴州省發酵工程及生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；3.貴州大學藥學院，貴州貴陽550025）

采用酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶分步酶解提取杜仲葉中的綠原酸，并經高效液相色譜(HPLC)法測定其中的綠原酸含量。杜仲葉經過酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶的分步連續酶解后，測得杜仲粉樣品中的綠原酸總含量可達到61.8 μg/g，其中酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶提取杜仲粉中綠原酸含量分別為26.4 μg/g、20.5 μg/g、14.9 μg/g，明顯高于水提法(12.2 μg/g)。

杜仲葉；綠原酸；酶解；高效液相色譜法

杜仲（Eucommia ulmoidesOlive）也被稱為“絲棉樹”、“絲棉皮”[1]，是200多萬年以前冰川活動殘留下來的一種多年生落葉喬木的古生物樹種[2]，起源于我國，已被列入《中國植物紅皮書稀有瀕危植物》中的二級珍稀物種[3]。杜仲具有降壓[4]、調血脂、降血糖、增強免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、保肝、利膽、利尿等作用[5]。綠原酸（chlorogenic acid）是杜仲具有降壓調節作用的重要藥效成分之一[6]，其主要藥效有雙向調整血壓、抗腫瘤、補腎[7]、改善機體免疫力、抗氧化、延緩衰老、抗菌、抗病毒等[8]。2005版中國藥典將綠原酸定為評估杜仲品質好壞的重要技術參數[9]。

杜仲天然藥物成分的提取研究一直廣受重視，引起大批學者的關注，采用的方法很多，如有機溶劑提取、乙醇系列濃度提取法、溶劑固相萃取法、超聲提取法[10]、微波提取法以及酶解法等，分離提純的方法有大孔樹脂分離法[11]、硅膠柱色譜分離法、高速逆流色譜技術[12]等。蘭小艷等[13]采用正交試驗確定了乙醇法提取杜仲葉中綠原酸的最佳工藝條件。冉琴琴等[14]采用角質酶破壞寄主植物中起保護作用的角質層，再通過蛋白酶、果膠酶和纖維素酶處理，可以更好提取杜仲葉中的綠原酸。

杜仲葉與杜仲樹皮相比簡便、大量、易得，而且綠原酸等含量高于杜仲皮且多分布于云、貴、川地區[15]。實驗采取多種生物酶，對杜仲葉進行全酶解，首先用酸性蛋白酶去除蛋白質組分，再用果膠酶與纖維素酶降解表層與黏連角質層的果膠質和粘連植物細胞壁的果膠質，降解分散植物細胞壁。采用酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶聯合酶促降解提取杜仲葉中的化學成分，并經高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定其中的綠原酸含量，從而達到對杜仲葉的全酶降解，實現有效成分的提取。深入探索杜仲資源的開發，以期增強我國中草藥在國際舞臺上的競爭力，加速中草藥的國際化進程。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

杜仲葉：貴州省遵義市遵義縣新舟鎮金仲村；酸性蛋白酶（5萬U/g）、果膠酶（5萬U/g）、纖維素酶（5萬U/g）：張家港市金源生物化工有限公司；β-環糊精（生化試劑）、異丙醇（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；檸檬酸（純度為99%）、檸檬酸鈉（純度為99%）：濰坊英軒實業有限公司；無水乙醇、磷酸（均為分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；乙腈（色譜純）：美國Tedia公司；綠原酸標準品（純度為98%）：阿拉丁試劑（上海）試劑有限公司；超純水為實驗室自制。

1.2儀器與設備

Agilent1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；FA2004B電子天平：沈陽龍騰電子科技有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計：日本島津公司；SHA-CA數顯水浴恒溫振蕩器：常州普天儀器制造有限公司；EYELA旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司；XW-80A漩渦混合儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；0.45μm微孔濾膜：上海興亞凈化材料廠；B01145AA貝克曼離心機：貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；SZ-96A自動純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1酶制劑的制作

（1）酸性蛋白酶制劑：酸性蛋白酶最適pH值為3.4，準確稱量33.62 g檸檬酸與11.77 g檸檬酸鈉，蒸餾水溶解并定容至2 000 mL。分4次與10 g酸性蛋白酶混合，合并收集4次洗脫液制成酸性蛋白酶液。

（2）果膠酶制劑：果膠酶最適pH為3.6，準確稱量31.30 g檸檬酸與15.00 g檸檬酸鈉，蒸餾水溶解并定容至2 000 mL。分4次與10 g果膠酶混合，合并收集4次洗脫液制成果膠酶液。

（3）纖維素酶制劑：纖維素酶最適pH為5，準確稱量17.23 g檸檬酸與34.71 g檸檬酸鈉，蒸餾水溶解并定容至2 000 mL。分4次與10 g纖維素酶混合，合并收集4次洗脫液制成纖維素酶液。

1.3.2樣品處理方法

杜仲葉酶解工藝流程：

水提?。涸诰幪枮?號、2號、3號和4號的4個1 000 mL三角瓶中分別加入50.0 g經小心揉碎成團（杜仲葉中含杜仲膠，揉碎后自動成團）且無損失的杜仲葉，加入500 mL蒸餾水，搖勻后置于50℃水浴床，180 r/min振蕩8.0 h后取出，合并收集并抽濾，將濾液置于旋轉蒸發儀上濃縮至100mL，加入無水乙醇400 mL至整個酶解液體系中的乙醇體積分數為80%，混合充分后靜置沉淀過夜。將經乙醇沉淀處理的水解液上清液與β-環糊精以8∶1（mL∶g）的比例充分混合均勻，將混合溶液置于旋轉蒸發儀（45℃、60 r/min）蒸干呈塊狀后粉碎，即為水提杜仲粉。

酸性蛋白酶提?。喝【幪枮?號、2號、3號和4號的4個1 000 mL三角瓶，分別加入50.0 g經小心揉碎，加入500 mL酸性蛋白酶制劑，置于55℃水浴搖床，180 r/min振蕩8.0 h后取出，合并收集濾液并抽濾，將濾液置于旋轉蒸發儀上濃縮至100 mL，加入無水乙醇400 mL至整個酶解液體系中乙醇體積分數為80%，劇烈振蕩混合充分后靜置沉淀過夜，稱取50 gβ-環糊精，將經乙醇沉淀的蛋白酶酶解液上清液與β-環糊精以8∶1（mL∶g）的比例充分混合均勻后，將混合溶液置于（45℃、60r/min）旋轉蒸發儀蒸干呈塊狀后，粉碎，即為酸性蛋白酶提取杜仲粉。

果膠酶提?。菏占鞍酌该附夂蟾鱾€三角瓶中所有杜仲葉殘余固體繼續進行果膠酶酶解。加入果膠酶制劑后后續處理，過程同蛋白酶酶解，即可得果膠酶提取杜仲粉。

纖維素酶提取：收集果膠酶酶解后各個三角瓶中所有杜仲葉殘余固體繼續進行纖維素酶酶解。加入纖維素酶制劑后后續處理過程同酸性蛋白酶酶解一致，即可得纖維素酶提取杜仲粉。

精密稱取水提杜仲粉、酸性蛋白酶提取杜仲粉、果膠酶提取杜仲粉以及纖維素酶提取杜仲粉各0.1 g于1.5 mL離心管中，分別加入1.5 mL體積分數95%乙腈溶液溶解，于漩渦混合儀上充分混勻，經4℃，10 000 r/min離心20 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾并轉移至樣品瓶中待測。

1.3.3綠原酸檢測方法

采用高效液相色譜法檢測樣品中綠原酸的含量。色譜柱為TOSOHTSKgelODS-100Z（5 μm×4.6 mm×250 nm），流動相A（0.4%磷酸水溶液）∶B（乙腈）=9∶91（V/V），檢測波長324 nm，流速0.6 mL/min，進樣量10 μL，柱溫40℃。

綠原酸標準曲線的繪制：精密稱取綠原酸標準品10.0mg，用體積分數為95%的乙腈溶液溶解，定容至100 mL，得質量濃度為0.1mg/mL標準儲備液，分別量取1.25mL、2.50mL、3.75 mL、5.00 mL、6.25 mL的0.4 mg/mL標準儲備液，并定容至10 mL，配制成質量濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL的標準溶液，所得溶液用0.45 μm濾膜過濾。分別吸取10 μL配制好的綠原酸標準溶液注入高效液相色譜儀中，按照上述色譜條件測定峰面積，并以綠原酸標準溶液的質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制綠原酸標準曲線。

2　結果與分析

2.1綠原酸檢測波長的選擇

準確稱取綠原酸標準品10.0 mg，用體積分數為95%的乙腈溶液溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，充分混勻，以超純水作對比，在波長為200～500 nm范圍內掃描，結果如圖1所示。

圖1　綠原酸標準品紫外吸收光譜Fig.1　Ultraviolet absorption spectrum of chlorogenic acid standard substance

由圖1可知，綠原酸標準品在波長324 nm處有最大吸收峰，故選擇324 nm為檢測綠原酸的最佳波長。

2.2綠原酸標準品及樣品高效液相色譜分析

綠原酸標準品高效液相色譜圖如圖2所示，杜仲葉水解液和3種酶解液高效液相色譜圖如圖3所示。

圖2　綠原酸標準品HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms of chlorogenic acid standard substance

由圖2可知，綠原酸標準品保留時間為3.806 min，峰形較尖銳，較窄，吸收相對較好。由圖3可知，水提杜仲粉、蛋白酶杜仲粉、果膠酶杜仲粉、纖維素酶杜仲粉在設定的色譜條件下均在3.8～4.0 min左右出現最大吸收峰，保留時間和綠原酸標準品的保留時間十分相近，可以判定其中均含有綠原酸。綠原酸在每步酶解時所占的比例并不是都很高，均不同程度的有其他雜峰出現，由此推斷還有其他組分存在，也同時說明經酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶連續分步酶解后可以使有效成分一并溶出。

圖3　杜仲葉水解液(a)、酸性蛋白酶酶解液(b)、果膠酶酶解解液(c)和纖維素酶解液(d)HPLC色譜圖Fig.3　HPLC chromatograms of hydrolysate(a),acid protease enzymolysis liquid(b),pectinase enzymolysis liquid(c) and cellulose enzymolysis liquid(d)of folium cortex eucommiae

2.3綠原酸標準曲線的繪制

以綠原酸標準溶液的質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制綠原酸標準曲線。結果見圖4。

圖4　綠原酸標準曲線Fig.4　Standard curve of chlorogenic acid

由圖4可知，由綠原酸標準曲線求得標準線性回歸方程為：y=552.20x-117.13，相關系數R2=0.999 2，表明兩者線性關系良好，可根據標準線性回歸方程計算各杜仲粉樣品中綠原酸含量。

2.4杜仲葉中綠原酸含量的檢測

根據1.3.3中的方法及2.3中的標準曲線測得的水、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶提取杜仲粉中的綠原酸含量如表1所示。

表1　杜仲粉中綠原酸的含量Table 1　Chlorogenic acid contents in folium cortex eucommiae powder

由表1可知，經酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶分別提取后，各步酶解的杜仲粉綠原酸含量分別為26.4 μg/g、20.5μg/g、14.9μg/g，三步酶解的綠原酸總量可達61.8μg/g，水提杜仲粉中綠原酸含量僅為12.1 μg/g，酶提法提取的綠原酸約為水提法提取的5倍多。隨著酶的加入，提取出綠原酸逐漸減少。酸性蛋白酶處理后提取的綠原酸最多，纖維素酶處理后提取的綠原酸最少，僅有14.9 μg/g，但仍比水提法多2.8 μg/g。說明多種酶連續分步酶解可使杜仲葉中的綠原酸大量溶出。

3　結論

本研究采用酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶對杜仲葉進行分步酶解，并采用高效液相色譜法對其綠原酸的含量進行測定。結果表明，隨著酶的不斷加入能提取出的物質逐漸變少，多種酶分步連續酶解后對于提取綠原酸十分有效，能達到充分提取的效果，經純水、酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶提取杜仲粉中綠原酸含量分別為12.1 μg/g、26.4 μg/g、20.5 μg/g、14.9 μg/g，酸性蛋白酶提取最多，果膠酶次之，纖維素酶最少，但仍然比水提取的綠原酸多2.8μg/g。相較于水提法來看，酶解法優勢明顯。

傳統中多采用水提法提取中藥草中的藥效成分，長時間煎煮不但耗能費時，還會破壞許多熱敏性的藥效成分。水提法不能將葉中的綠原酸盡可能多的提出，因杜仲葉中的活性物質大多存在于細胞壁包被的葉細胞內，通過生物酶水解破壞杜仲的葉片結構和細胞壁使藥效成分加快釋放，充分提取，因此，酶解法提取杜仲中的綠原酸發展前景十分廣闊。

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Extraction of chlorogenic acid from folium cortex eucommiae by enzymatic hydrolysis method and determination of its content

ZHANG Xuemei1,2,XIE Jinrui3,CHEN Yufu1,2,ZHANG Xuejun1,2*
(1.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering&Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.School of Liquor&Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.School of Pharmaceutical Sciences,Guiyang 550025,China)

The chlorogenic acid from folium cortex eucommiae was extracted by acid protease,pectinase and cellulase,and the content was determined by high performance liquid chromatography(HPLC).After continuous hydrolysis by acid protease,pectinase and cellulase in sequence, the total content of chlorogenic acid from folium cortex eucommiae was up to 61.8 μg/g,and the content of chlorogenic acid extracted by acid protease,pectinase and cellulase were 26.4 μg/g,20.5 μg/g and 14.9 μg/g,respectively,which was significantly higher than that of water extraction (12.2 μg/g).

folium cortex eucommiae;chlorogenic acid;hydrolysis;HPLC

Q55

0254-5071（2016）10-0149-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.033

2016-05-19

校正合作項目（筑科合同[2011102]109）

張雪梅（1990-），女，碩士研究生，研究方向為微生物學、天然產物化學。

張學?。?952-），男，教授，博士，研究方向為化學生物學，酶化學和天然產物化學。