不同添加物對大麥發芽過程中熱穩定蛋白含量的影響

趙旭樂，管斌，*，孔青，董建軍，尹花，侯松珍，余俊紅，楊梅

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.青島啤酒股份有限公司，山東青島266061）

不同添加物對大麥發芽過程中熱穩定蛋白含量的影響

趙旭樂1，管斌1，2*，孔青1，董建軍2，尹花2，侯松珍2，余俊紅2，楊梅2

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.青島啤酒股份有限公司，山東青島266061）

為了解發芽過程中熱穩定蛋白動態變化趨勢，以澳麥為原料，模擬工業制麥條件，系統分析了麥芽制備過程中熱穩定蛋白分布變化。通過在浸麥最后一天添加Mg2+、K+、赤霉素(GA3)調節蛋白酶酶活及分解。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳和考馬斯亮藍法(Bradford法)，研究添加金屬離子及赤霉素后熱穩定蛋白分布及含量。結果表明，麥芽中熱穩定蛋白分子質量主要分布在約40 ku和10 ku兩個區域。經制麥后，40 ku分子質量蛋白質含量增加，10 ku附近蛋白質含量變化不明顯。Mg2+和赤霉素添加降低了熱穩定蛋白含量，K+有利于熱穩定蛋白含量增加。

熱穩定蛋白；制麥添加物；赤霉素

在不添加輔助用料的情況下，麥芽是啤酒中蛋白的唯一來源。麥芽中蛋白質經浸麥、發芽、糖化、煮沸及發酵等各種釀造工序后，大部分蛋白質在酶的作用下分解為小分子量蛋白質、多肽和氨基酸，或受其他條件影響發生沉降，只有少部分轉移到啤酒中，這部分蛋白與啤酒中發泡蛋白含量有密切聯系[1-3]。熱穩定蛋白因耐受高溫而不發生絮凝，具有優異的熱穩定性[4-5]，是成品啤酒中蛋白質的主要來源，成為決定啤酒泡沫穩定性及風味等品質指標的重要因素[6]，具有很大的商業價值。啤酒泡沫是啤酒的重要質量指標，作為啤酒泡沫骨架的蛋白質是構成泡沫最主要的因子，是解決泡沫問題根本途徑。

研究表明，蛋白質Z和脂質轉運蛋白（lipid transfer protein，LTP）都具有熱穩定性和對蛋白水解酶的抗性，是大麥熱穩定蛋白重要組成部分[7]，其中蛋白質Z分子質量約43 ku，作為胚乳中的貯藏清蛋白，占大麥清蛋白總量的5%左右，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。胚乳中蛋白質Z有自由態和結合態兩種形式[8-9]，結合態在發芽過程中隨著胚乳的溶解不斷釋放，成為自由態蛋白質。脂質轉運蛋白LTP1分子質量約為10 ku的小分子球蛋白，存在于大麥糊粉層清蛋白中，可作為種子的淀粉酶和蛋白酶的抑制劑（probable amylase/protease inhibitor，PAPI）[10-11]，能夠抑制半胱氨酸和絲氨酸蛋白酶的活力。

目前，主要通過外源添加蛋白酶方式調節蛋白組分分解，酶化學本質是蛋白質，添加酶制劑會在啤酒中形成沉淀影響啤酒品質[12-13]，如何使大麥發芽后，麥芽中自身蛋白酶產生量控制在合理范圍內，從而滿足后續發酵過程中既為酵母菌提供足夠營養，又不過度分解影響啤酒泡沫具有重要意義[14-15]。

赤霉素（gibberellic acid，GA3）是植物在萌發過程中產生的植物激素，也是目前啤酒工業上常用的添加劑，可誘導α-淀粉酶、蛋白酶、脫支酶、纖維素外切酶等多種酶類的形成[16-17]。金屬離子對酶的激活作用可以通過與酶分子上的氨基酸側鏈基團相結合，或與酶或底物的中間物結合，也可作為輔酶或輔基的一個組成部分而起作用。因此，可通過添加金屬離子和赤霉素來調節蛋白酶酶活，從而調節蛋白質分解，使蛋白質分解達到有利范圍。

本實驗以大麥為研究對象，觀察大麥發芽過程中添加金屬離子和赤霉素后，熱穩定蛋白變化規律。研究添加不同量K+、Mg2+和赤霉素（GA3）[18-21]調節蛋白酶酶活后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及考馬斯亮藍法（Bradford法）對蛋白質分布及含量進行研究，使蛋白質組成及含量有利于泡沫蛋白形成。為啤酒工業中工藝調節提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

以青島啤酒股份有限公司提供的澳麥Gairdner為原料，在制麥機上模擬工業制麥條件。

G-250染料：天津市科密歐化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（分析純）：上海阿拉丁生化試劑股份有限公司；氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣（均為分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；赤霉素（GA3）（純度＞90%）：生工生物工程（上海）股份有限公司；甲叉雙丙烯酰胺（N,N'-methylene bisacrylamide，MBA），十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PAM）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）：美國Sigma公司；低分子質量（1.2～66.2 ku）標準蛋白：美國Thermo公司；β-巰基乙醇、過硫酸銨（ammonium persulfate，AP）、甘氨酸、溴酚藍、考馬斯亮藍R-250：國藥集團（上海）化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

722型可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；TGL-16G高速冷凍離心機、TDL-5低俗離心機：上海安亭科學儀器廠；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀、DYC-28A型垂直式電泳槽：北京六一生物科技有限公司；微型制麥儀：德國Seeger公司。

1.3方法

1.3.1大麥相關指標及麥芽制備工藝

表1　釀造大麥相關指標及麥芽制備工藝Table 1　Brewing barley indicators and malting process

利用制麥儀模擬工業制麥條件，同批次可處理8個1 kg樣品。浸麥及發芽工藝條件如表1所示。澳麥Gairdner浸麥工藝采用浸三斷三法，即浸水9 h/斷水10 h/浸水7 h/斷水8 h/浸水6 h，接著直接進入發芽階段（16±1）℃、96 h。

1.3.2赤霉素（GA3）及金屬離子添加

Mg2+、K+分別以MgCl2、KCl的形式添加，濃度梯度均為0、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg，在最后一次浸麥時以噴淋方式添加。GA3添加時間和方式同金屬離子，添加濃度梯度為0、0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.3 mg/kg、0.4 mg/kg。

1.3.3熱穩定蛋白的提取及含量測定[4]

麥芽制備過程中，添加不同濃度金屬離子及赤霉素，并測定制麥過程中總的熱穩定蛋白含量變化。稱取適量待測樣品，加一定量提取液（NaCl 10 mmol/L，Tris-HCl 50 mmol/L，乙二胺四乙酸二鈉1 mmol/L，二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）1 mmol/L），搖勻后置于4℃、浸提2 h，每隔一段時間后搖勻。4 000 r/min離心，上清液即為蛋白粗提液，將粗提液置于沸水浴中20 min后，4 000 r/min離心，上清液即為熱穩定蛋白提取液，采用Bradford法測定樣品中蛋白質含量。

1.3.4SDS-PAGE電泳

電泳使用不連續系統在4℃條件下進行，15%分離膠，5%濃縮膠。若提取液蛋白含量較低，可先經丙酮沉淀濃縮。電泳結束后染色1～2 h，后將凝膠置于脫色液中，至背景清晰明亮。以制麥過程中熱穩定蛋白提取液為原料進行SDS-PAGE電泳，上樣量為10～15 μL。

1.3.5數據處理

本試驗中主要采用Excel、Origin對所得數據進行處理。

2　結果與分析

2.1大麥及麥芽相關指標

啤酒釀造的各環節對啤酒成品的質量都有影響，有文獻指出[22]，大麥、麥芽對啤酒成品質量包括啤酒色度、泡沫等的影響分別為25%、17%。蛋白質含量高的大麥溶解困難，進一步影響淀粉類物質的分解，浸出率低，麥芽利用率低。蛋白質含量高的大麥需要浸麥時間相對延長，才能達到較高的浸麥度，使大麥粒充分吸水，有利于大麥粒的發芽及淀粉等物質充分溶解，避免形成玻璃質。表1為澳麥Gairdner經發芽后的成品麥芽品質指標。由表2可知，麥芽的浸出物含量高，即淀粉類和蛋白類的溶解度高，有利于原料利用率提高。糖化力、氨基酸態氮含量高，質量適宜用于釀造。

表2　澳麥Gairdner麥芽品質指標Table 2　Quality indicators of Gairdner malt

2.2Mg2+對熱穩定蛋白含量的影響

Mg2+是多種酶的活化因子，是三大營養物質（碳水化合物、蛋白質、脂肪）代謝的相關酶類的活化劑并參與遺傳物質核酸的合成，是植物體的一種必需元素[18，23]。發芽階段每次間隔24 h取樣，為發芽1 d、發芽2 d、發芽3 d、發芽4 d，采用SDS-PAGE方法對添加不同質量濃度Mg2+的各樣品中熱穩定蛋白分布進行分析，結果見圖1。在浸麥最后一天，以氯化鎂形式添加Mg2+，測定制麥過程中熱穩定蛋白含量變化，結果如圖2所示。

圖1　添加Mg2+后熱穩定蛋白電泳結果Fig.1　SDS-PAGE of heat-stable protein with Mg2+addition

圖2　Mg2+對熱穩定蛋白含量影響Fig.2　Effect of Mg2+on heat-stable protein content

由圖1可知，40 ku附近蛋白質條帶隨著發芽過程進行而明顯增加，即蛋白質Z含量的增加，可能是結合態不斷轉變為自由態。蛋白質Z在胚乳中以自由和結合兩種形式存在[9，24]，發芽過程中隨著胚乳的溶解，后者不斷釋放，成為自由形式，處于自由態時可溶于水和鹽溶液。在發芽第1天，14.4～20.1 ku蛋白質含量相對少，隨著發芽過程進行，各種水解酶類被激活或重新合成，貯藏蛋白得到分解，使14.4～20.1 ku內蛋白質含量增加。由圖2可知，浸麥階段，熱穩定蛋白含量的有下降趨勢，隨發芽過程持續，蛋白質含量不斷增加并在發芽最后一天達最大值。添加鎂離子后，熱穩定蛋白含量減少。蛋白質Z絲氨酸蛋白酶類抑制劑，脂轉移蛋白（lipid transfer protein，LTP）是半胱氨酸蛋白酶類抑制劑，鎂離子可能對這兩種蛋白有激活作用[19，24]。隨著蛋白酶被激活，蛋白質分解增加。

2.3K+對熱穩定蛋白的影響

K+是生物體必須的大量元素中一種，是構成細胞滲透勢的重要組分。在植物體內K+幾乎全部呈離子狀態，鉀不參與重要有機物的組成，主要作為植物體內各種生化反應中的酶的活化劑，如通過對三大營養物質代謝必須丙酮磷酸激酶的活化影響呼吸速率，活化蛋白質代謝過程中谷胱甘肽合成酶[18，23]等。發芽階段每次間隔24 h取樣，為發芽1 d、發芽2 d、發芽3 d、發芽4 d，采用SDS-PAGE方法對各樣品中熱穩定蛋白分布進行分析，結果見圖3。按1.3.2方法添加金屬鉀離子，測定發芽過程中熱穩定蛋白含量變化，結果見圖4。

圖3　添加K+的熱穩定蛋白電泳結果Fig.3　SDS-PAGE of heat-stable protein with K+addition

圖4　K+對熱穩定蛋白含量影響Fig.4　Effect of K+on heat-stable protein content

由圖3可知，在發芽最后一天，在6.2～20.1 ku內，蛋白質條帶增多，熱穩定蛋白含量在6.2～20.1 ku范圍內分布增多。由圖4可知，K+加入后，熱穩定蛋白含量增加，可能是K+促進了熱穩定蛋白向自由態轉化，當K+添加量為60 mg/kg時，熱穩定蛋白總含量增加40%，在發芽最后一天，熱穩定蛋白含量達到最大值。K+是多種酶的活化劑，K+的添加有利于酶活的增加，對麥芽中貯藏蛋白的分解有促進作用。2.4赤霉素（GA3）對熱穩定蛋白含量的影響

赤霉素（GA3）是植物激素的一種，在未發芽大麥中赤霉素（GA3）以束縛態形式存在，在萌發過程中，束縛態轉化為游離態發揮生物調節作用[17，26]。赤霉素（GA3）是由胚合成并分泌到胚乳中，但只有擴散到糊粉層才能誘導各種水解酶類的合成[18，22]。外源添加GA3，可以促進各種水解酶類的形成而無需使種子發芽。發芽階段每次間隔24 h取樣，為發芽1 d、2 d、3 d、4 d，采用SDS-PAGE方法對各樣品中熱穩定蛋白分布進行分析，結果見圖5。按照1.3.2方法添加赤霉素（GA3），測定發芽過程中熱穩定蛋白含量變化，結果見圖6。

圖5　添加GA3的熱穩定蛋白電泳結果Fig.5　SDS-PAGE of heat-stable protein with GA3 addition

圖6　GA3對熱穩定蛋白含量影響Fig.6　Effect of GA3 on heat-stable protein content

由圖5可知，赤霉素添加明顯促進了蛋白質分解活動，在進入發芽第一天后，電泳圖譜中位于14.4～20.1 ku的條帶明顯增多，此范圍內蛋白質含量增加。糊粉層中熱穩定蛋白的合成與組織中脫落酸的含量之間存在某種正相關關系，而在浸麥初期，大麥糊粉層中脫落酸含量與赤霉素含量呈負相關，赤霉素添加抑制了麥芽中脫落酸合成，這也可能是導致熱穩定蛋白含量下降的因素之一[17]。由圖6可知，雖然赤霉素添加可以促進蛋白質分解，增加大麥汁得率，降低生產成本，但隨發芽過程的進行，位于40 ku附近蛋白條帶，在發芽最后一天明顯變淺，即蛋白含量減少，最終會對啤酒泡沫產生影響。

2.5麥芽熱穩定蛋白與啤酒泡沫蛋白

麥芽熱穩定蛋白與啤酒泡沫蛋白的SDS-PAGE圖譜見圖7。由圖7可知，相較于原料大麥，經發芽過程后，麥芽中蛋白條帶明顯減少，特別是分子質量在20.1～43 ku的蛋白質，這可能是因為蛋白酶的分解作用。處于約40 ku附近的蛋白質含量明顯增多，在6.2～20.1 ku范圍內一直分布較多蛋白質。對比大麥、麥芽、啤酒泡沫蛋白可知，麥芽和啤酒中都含有40 ku、6.2～14.4 ku蛋白質，而這兩種分子質量蛋白都被認為對啤酒泡沫形成有積極作用，可在生產中依據這兩種蛋白的含量，預測成品啤酒中泡沫蛋白的含量。

圖7　熱穩定蛋白電泳結果Fig.7　SDS-PAGE of heat-stable protein

3　結論

利用微型制麥儀模擬工業制麥環境，以澳麥Ganider為原料，在浸麥最后一天添加金屬離子及赤霉素（GA3）調節麥芽中蛋白酶酶系的活性，并比較了添加金屬離子及赤霉素（GA3）后熱穩定蛋白含量變化，從電泳條帶分析，處于40 ku附近蛋白質較為穩定，各種物質添加不改變其分布。添加赤霉素明顯促進了6.2～20.1 ku分子質量范圍內蛋白質含量，各蛋白條帶分散開來。從總體含量上來講鎂離子和赤霉素添加降低了熱穩定蛋白含量，鉀離子有利于熱穩定蛋白生成。

本研究建立了測定大麥發芽過程中熱穩定蛋白的含量和變化趨勢的方法，研究表明，麥芽中熱穩定蛋白分子量主要分布在約40 ku和10 ku兩個區域。在電泳圖譜7中40 ku處條帶和10 ku的條帶分別為蛋白質Z和LTP1。在發芽進程中隨著胚乳的溶解，結合態蛋白質Z不斷釋放，因此在電泳圖譜7中能夠觀察到蛋白質Z含量的增加，LTP1含量基本穩定。

對比麥芽中熱穩定蛋白及啤酒中泡沫蛋白分布規律，建立啤酒泡沫蛋白與麥芽中熱穩定蛋白間聯系從而為制麥工藝的調節提供依據。今后可從分子組成和結構角度進一步探明賦予其熱穩定性的因素和機理，將為隨后應用蛋白質工程手段改造和生產具有商業價值的耐熱蛋白創造條件。

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Effects of different additives on heat-stable proteins content in malting process

ZHAO Xule1,GUAN Bin1,2*,KONG Qing1,DONG Jianjun2,YIN Hua2,HOU Songzhen2,YU Junhong2,YANG Mei2
(1.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China; 2.Tsingtao Brewery Co.,Ltd.,Qingdao 266061,China)

In order to know the dynamic changes of heat-stable proteins during malting process,the heat-stable proteins were studied under simulated condition in industry.The protease activity and protein degradation were regulated by adding Mg2+,K+and gibberelin(GA3)at the last day of malt steeping.The metal ions and GA3 addition on heat-stable protein distribution and contents was studied by SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue staining(Bradford)method.Results showed that the heat-stable proteins in malt were mainly distributed in the molecular mass of 40 ku and 10 ku.The content of proteins with molecular mass of 40 ku was significantly increased,while the contents of proteins with molecular mass of 10 ku was not obviouslychangedaftergermination.Theheat-stableproteinscontentsweredecreasedbyaddingMg2+andGA3,whiletheywereincreasedbyaddingK+.

heat-stable protein;malting additives;gibberelin

TS262.5

0254-5071（2016）10-0144-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.032

2016-06-07

山東省自然科學基金資助項目（ZR2010CM050）；啤酒生物發酵工程國家重點實驗室開放課題（K2012002）；青島市公共領域科技支撐計劃項目（11-2-3-63-nsh）

趙旭樂（1989-），女，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

管斌（1957-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程方面。