甘蔗糖廠成糖工序生產線樣品中部分細菌菌株的鑒定

游彪，毛瑞豐*，許鳴銳，江燎瑩，劉雅楠，黃結

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530000）

甘蔗糖廠成糖工序生產線樣品中部分細菌菌株的鑒定

游彪，毛瑞豐*，許鳴銳，江燎瑩，劉雅楠，黃結

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530000）

通過16S rRNA序列分析，結合微生物的形態學觀察、生理生化試驗對甘蔗糖廠成糖工序生產線檢出的部分細菌進行了分離鑒定。結果顯示，從甘蔗糖生產線樣品中獲得常見的4株菌，菌株S-1鑒定為克氏庫克菌(Kocuria kristinae)、菌株S-2為蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、菌株S-3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、菌株S-4為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。因此，糖廠應該加強微生物污染源和污染途徑的監控，以此保證甘蔗糖品質。

甘蔗糖；鑒定；克氏庫克菌；蠟樣芽胞桿菌；解淀粉芽孢桿菌；枯草芽孢桿菌

甘蔗糖作為甜味劑已經有很長的歷史了，除此之外它還能夠改變食品的風味、色澤和質地[1]，是一種天然的食品添加劑。由于其具有豐富的營養成分[2]，加上粗放的生產工藝，因此在壓榨時常常受到明串球菌屬（Leuconostoc sp.）[3-4]的污染，而在成品糖中極易受到嗜溫細菌、嗜熱細菌和嗜熱產芽孢菌[1]以及霉菌[5]的污染。

成品糖中的微生物極有可能來自上游工序—成糖工序，作為唯一的潔凈區，它依次包括落糖口、一級振篩、二級振篩、三級振篩、流化床、四級振篩，該工段也是糖廠進行微生物控制的關鍵工序，但是它完全暴漏在空氣中且非常容易積垢。李揚[5]在成糖工序曾對其中的霉菌做過相關的研究，結果發現成糖工序檢出的菌株與成品糖中的菌株具有相關性。目前對甘蔗糖成糖工序的細菌種屬研究較少，在食品行業中還沒有意識到甘蔗糖中的細菌會對食品生產、貯藏以及消費者的健康帶來多大的影響。因此，本研究立足于成品糖成糖工序的四級振篩這一關鍵控制點，研究該點的細菌種類，為以后的研究做好鋪墊。

由于16S rRNA序列分析檢測技術具有時間短、靈敏度高、特異性強以及不依賴微生物的純培養技術的特點[6]，被廣泛運用于食品[7-8]、藥品[9]、臨床[10]中細菌種類的鑒定。本研究借助16S rRNA序列分析方法，對成糖工序四級振篩上物料中的細菌進行分類鑒定，并構建系統發育進化樹，以期為甘蔗糖中的微生物控制提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品

甘蔗糖樣品：廣西壯族自治區某糖廠。

1.1.2培養基

胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養基：胰酶水解的酪素17.0 g/L，胃酶水解的大豆3.0 g/L，氯化鈉5.0g/L，磷酸氫二鉀2.5g/L，一水葡萄糖2.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.3±0.2（25℃），121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3試劑

結晶紫、孔雀綠、碘單質、體積分數95%乙醇溶液、葡萄糖、亞硝酸鹽（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

細菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、PremixTaqTM：寶生物工程（大連）有限公司；27F/1492R通用引物：北京六合華大基因科技股份有限公司；Biowest Regular Agarose G-10：基因科技（上海）股份有限公司；4S Red Plus核酸染色劑：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2儀器與設備

SH11/YF-9光學顯微鏡：桂林市邁特光學儀器有限公司；5430R高速小型離心機：德國Eppendorf公司；Mini-Sub Cell GT Cell電泳槽、164-5050 Powerpac Basic電泳儀、CHEMIDOC XRS免染電泳成像系統：美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1菌株的分離純化

在無菌條件下稱量1 g四級振篩上的物料，置于已滅菌的平板中，取15 mL倒入已經滅菌冷卻至50℃的TSB培養基中，輕輕搖動平板，混合均勻，平放于無菌操作臺上，冷卻后倒置于37℃恒溫箱中培養2 d。待培養基中長滿菌落后，從平板中挑取單菌落于TSB培養基中劃線，37℃培養2 d，重復進行上述劃線操作，直到獲得純化的菌株為止。

1.3.2菌株生理生化試驗

對所得純化菌株進行生理生化鑒定，試驗操作參見《常見細菌鑒定手冊》[11]。

1.3.316S rRNA基因序列分析

利用細菌基因組DNA提取試劑盒對菌株進行基因組DNA的提取，方法步驟詳見試劑盒說明書。利用通用引物27F/1492R對基因組進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，PCR反應體系見表1。反應條件為：98℃變性10 s，55℃退火30 s，27次循環，72℃延伸96 s，得到16S rRNA基因片段，經過1%瓊脂糖凝膠電泳，條帶明亮的樣品送至華大基因（深圳）測序。測序結果通過美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行比對，從而確定與數據庫中序列相似性。并且利用MEGA 6中的鄰接法（neighbour-joining，NJ）構建系統發育樹。

表1　PCR反應液的組成Table 1　Composition of PCR reaction liquid

2　結果與分析

2.1菌株形態特征

經過分離純化后，從四級振篩物料中得到菌株根據菌落特征和細胞形態特征，初步將分離菌株劃分為兩類：L-1、L-2，常見的4株菌株為S-1、S-2、S-3、S-4。

表2　分離菌株的細胞和菌落形態特征Table 2　Cell and colony morphological characteristics of isolated strains

經過上述初步的形態學鑒定，本試驗又對這兩類菌株進行了革蘭氏染色、芽孢染色、運動性測定，結果見表2。由表2可知，分離菌株均為革蘭氏陽性菌株（G+），L-1類中的菌株不具有運動性，而L-2類的菌株都具有運動性，且具有芽孢。因此，通過上述的形態學鑒定后，對分離純化過程中常見的4株菌S-1、S-2、S-3、S-4進行生理生化試驗。

2.2生理生化結果

分離菌株S-1、S-2、S-3、S-4、S-5的生理生化試驗結果見表3。

表3　分離菌株生理生化試驗結果Table 3　Results of physiological biochemical tests of isolated strains

由表3可知，參照《常見細菌鑒定手冊》初步鑒定菌株S-1為微球菌屬（Micrococcus）；菌株S-2、S-3、S-4為芽孢桿菌屬（Baciilus）。

2.316S rRNA序列分析與系統發育樹的構建

通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測16S rRNA擴增電泳產物，PCR擴增產物電泳圖見圖1。

由圖1可知，分離菌株的16S rRNA PCR擴增產物的分子質量在1 000～2 000 bp之間。將分離菌株的16S rRNA序列測序結果與NCBI數據庫中已報道的模式菌株序列進行比對，每種菌株列舉了3株近緣菌株，結果見表4。

圖1　分離菌株的16S rRNA PCR擴增產物電泳圖Fig.1　PCR amplification product electrophoretogram of 16S rRNA of isolated strains

表4　4株細菌的16S rRNA序列比對結果Table 4　Comparison results of 16S rRNA sequence of four strains of bacteria

由表4可知，菌株S-1與模式菌株克氏庫克菌（Kocuria kristinae）序列匹配率達到了98%；菌株S-2與模式菌株蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）序列匹配率達到了98%；菌株S-3與模式菌株解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）序列匹配率達到了99%；菌株S-4與模式菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）序列匹配率也達到了99%。

采用MEGA 6軟件中的鄰接法構建系統發育樹，結果見圖2～圖5。

圖2　菌株S-1基于16S rRNA序列建立的系統發育樹Fig.2　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-1

圖3　菌株S-2基于16S rRNA序列建立的系統發育樹Fig.3　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-2

圖4　菌株S-3基于16S rRNA序列建立的系統發育樹Fig.4　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-3

圖5　菌株S-4基于16S rRNA序列系統發育樹Fig.5　Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain S-4

由系統發育樹的構建結果可知，菌株S-1、S-2、S-3、S-4分別鑒定為克氏庫克菌（Kocuria kristinae）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3　結論

本研究對甘蔗糖廠成糖工序四級振篩物料中的部分細菌菌株進行分離鑒定，通過形態學、生理生化試驗、16S rRNA序列分析，分離菌株S-1、S-2、S-3、S-4分別鑒定為克氏庫克菌（Kocuria kristinae）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

通過對檢出菌株的文獻檢索，本研究發現試驗中的四級振篩存在著可以致病的菌株：克氏庫克菌（Kocuria kristinae）[15]和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）[16]，表明甘蔗糖有可能引起食源性疾病；產芽孢細菌的耐受性強，這將會對下游的食品加工中微生物的控制造成較大地影響。因此，在甘蔗糖的過程生產中有必要加強對細菌菌株的檢測和控制。

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Identification of some bacteria strains from samples in sugar process production line of sucrose factory

YOU Biao,MAO Ruifeng*,XU Mingrui,JIANG Liaoying,LIU Yanan,HUANG Jie
(College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Guangxi Nanning 530000)

Some bacteria strains from samples in sugar process production line of sucrose sugar factory were isolated and identified by 16S rRNA sequence analysis,morphology observation and physiological biochemical tests.The results showed four strains of common bacteria were obtained from samples of sucrose sugar production lines.Strain S-1,S-2,S-3 and S-4 were identified asKocuria kristinae,Bacillus cereus,Bacillus amyloliquefaciensandBacillus subtilis,respectively.Therefore,sugar factory should strengthen the strengthen monitoring of microbial pollution source and pollution approach.

sucrose sugar;identification;Kocuria kristinae;Bacillus cereus;Bacillus amyloliquefaciens;Bacillus subtilis

TS207

0254-5071（2016）10-0126-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.028

2016-03-10

游彪（1991-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物。

毛瑞豐（1963-），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物。