響應面法優化黃漿水發酵生產單細胞蛋白的工藝參數研究

車穎潔，郝林*

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

響應面法優化黃漿水發酵生產單細胞蛋白的工藝參數研究

車穎潔，郝林*

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

以大豆黃漿水為原料，選用白地霉、扣囊擬內孢霉、解脂假絲酵母和產朊假絲酵母（2∶1∶1∶2）作為發酵菌株發酵黃漿水。在單因素試驗的基礎上，通過響應面設計法，對黃漿水發酵生產單細胞蛋白（SCP）的工藝進行研究。結果表明，影響SCP產量的因素大小順序為初始pH、發酵時間、裝液量；最佳發酵工藝參數為碳氮比5、初始pH 6、裝液量140 mL/250 mL、接種量6%、發酵溫度28℃、發酵時間42 h；經過優化后的SCP產量達到3.28 g/100 mL。

黃漿水；單細胞蛋白；響應面法；玉米淀粉水解糖

黃漿水是指從豆腐壓榨到成型的過程中，為了使豆腐獲得特定的含水量、彈性特征等，必須施加一定的壓力把內部多余的水分通過布包排出，豆漿中的蛋白被凝固劑凝結成固體豆腐，豆腐與水分開，分離出來的壓濾廢水[1]。黃漿水作為豆腐加工企業的副產品，來源廣泛，價格低廉，含有蛋白質、脂類、糖類、維生素、礦物質、檸檬酸、維生素、色素、可溶性固形物等，其中生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）達7 400 mg/L，化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）達10 000 mg/L，總氮和氨氮（NH3-N）也較高，不能直接排放。目前企業主要采用生化處理方式，在曝氣池進行降解有機物，投資大且效率低[2]。

單細胞蛋白（single cell protein，SCP）又稱微生物蛋白或菌體蛋白，是利用工業廢水、天然氣、農副加工產品、石油烷烴類以及有機垃圾等作為培養基，培養酵母、細菌、微型菌、真菌等單細胞生物體，然后經過凈化干燥處理后制成，是食品和飼料工業重要蛋白質的來源，不僅可以作為飼料，還可以作為深加工的原料[3-4]。近年來，隨著利用農副產品廢料可生產SCP的報道越來越多，成為人類關注的熱點。在飼料中SCP被作為一種重要的蛋白質增補劑來代替常規蛋白質。

本試驗利用多種酵母及霉菌發酵黃漿水[5-7]。由于每種菌對生長繁殖條件都有不同的要求，因此，必須研究適合于混合培養的發酵條件以達到充分利用廢水中有效物質的目的，在發酵SCP的同時凈化廢水。該文通過對初始pH、碳氮比（C/N）、接種量、發酵溫度、發酵時間、裝液量等影響發酵的主要因素進行研究，從而使發酵工藝得到優化。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種與原料

白地霉（GeotrichumcandidumSH501）：山西農業大學食品院微生物實驗室保藏菌種；扣囊擬內孢霉（Endomycopsis fiburigerCICC31258）、解脂假絲酵母（Candida lipolyticaCICC32457）、產朊假絲酵母（Candida utilisCICC31268）：均購于中國食品發酵工業研究院；

大豆黃漿水：取自豆制品加工企業；玉米粉：市售。

1.1.2試劑

糖化酶（100 000 U）、淀粉酶（10 000 U）：江蘇銳陽生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：天津市科密歐試劑開發中心；酒石酸鉀鈉：天津市登峰化學試劑廠。

1.1.3培養基

（1）麥芽糖培養基：蛋白胨10 g、麥芽糖20 g、酵母膏5 g、瓊脂15 g、水1 000 mL，自然pH，在0.1 MPa、121℃條件下滅菌20 min。

（2）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1 000 mL，煮沸30 min，雙層紗布過濾，濾液中加2%葡萄糖，補充水分，加2%瓊脂，自然pH，在0.075 MPa、115℃條件下滅菌30 min。

1.2儀器與設備

ZWY-2102C恒溫培養振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；5804R-臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；BL-58A滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；水平型超凈工作臺：上海力申科學儀器有限公司；BPH-9052電熱恒溫培養箱：北京市光明醫療儀器廠；BPH-9000電熱恒溫鼓風干燥箱：北京醫療設備廠；WB-200水浴鍋：鄭州長城科工貿有限公司。

1.3方法

1.3.1單因素發酵條件的篩選

選取初始pH、碳氮比（C/N）、接種量、發酵溫度、發酵時間、裝液量6個因素依次進行單因素發酵試驗[8-12]。各因素的水平梯度設置分別為：初始pH值4、5、6、7、8；C/N 2.5（無外加碳源）、5、7、9、11；接種量（白地霉∶扣囊擬內孢霉∶解脂假絲酵母∶產朊假絲酵母=2∶1∶1∶2）2%、4%、6%、8%、10%；發酵時間24 h、30 h、36 h、42 h、48 h，發酵溫度24℃、26℃、28℃、30℃、32℃；裝液量為80mL/250mL、100mL/250mL、120 mL/250 mL、140 mL/250 mL、160 mL/250 mL。根據單因素試驗結果，確定各個因素的最佳水平值，為響應面試驗提供依據，以便研究發酵的最佳條件。

1.3.2C/N比的調整方法

發酵液的C/N主要通過玉米粉水解糖[13-14]作為外加碳源進行調整。玉米淀粉水解糖的制備方法為：準確稱取100 g玉米粉于500 mL的燒杯中，加入200 mL蒸餾水攪拌均勻；然后按照順序進行糊化、液化、糖化等。首先進行糊化，加入1 mL氯化鈣溶液以保證Ca2+含量，用5%的碳酸鈣調pH至6.2、在95℃水浴鍋中糊化15 min；然后進行液化，加入1g活力為10 000 U的淀粉酶，在70℃水浴液化4～5 h，90℃滅活20 min，用碘液變褐為終點進行檢測；最后糖化，在液化好的玉米粉水解液中加入1 g活力為100 000 U的糖化酶，在60℃水浴糖化8～9 h，后在80℃水浴滅活30 min，向無水乙醇中滴入糖化液1～2滴，若無白色沉淀則達到糖化終點。然后根據農業部標準用DNS法對水解糖中的還原糖進行測定，利用葡萄糖標準曲線進行計算得到玉米淀粉水解液中的還原糖含量[15-17]。

1.3.3單細胞蛋白含量的測定

經過發酵后的黃漿水在臺式離心機中以4 000 r/min離心20 min，然后在70℃烘箱中烘干至質量恒定，即得SCP的質量。

1.3.4響應面法優化發酵條件[17-22]

根據響應面試驗的設計要求，對單因素試驗的結果進行分析，篩選出3個顯著因子（pH、時間、裝液量），以單細胞蛋白含量為評價指標進行響應面優化試驗，試驗因素水平見表1。

表1　響應面試驗因素與水平Table 1　Factors and levels of response surface methodology

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

將單因素試驗結果匯總，以SCP的產量為評價指標，篩選出最佳發酵因素及其水平，為響應面試驗提供依據，試驗結果見表2。

表2　單因素試驗結果Table 2　Result of single factor experiment

根據表2可知，SCP產量隨著初始pH的增大呈現先增大后減小的趨勢，在初始pH為6時，達到最大；隨著C/N的逐漸增大，SCP產量逐漸減小，且在C/N為5時SCP產量最大；SCP產量隨著初始接種量的增大逐漸增大，在接種量為6%時達到最大，后逐漸減小；隨著發酵時間的延長，SCP產量逐漸增大，在42 h時產量達到最高，后逐漸減小；隨著發酵溫度的升高，SCP產量逐漸增大，在28℃時產量達到最高，之后逐漸減小；隨著裝液量的增加，SCP產量逐漸增大，在140 mL/250 mL時達到最大，后開始減小。因此，得到發酵條件為初始pH 6、C/N為5、接種量6%、溫度28℃、時間42 h、裝液量140 mL。

2.2響應面試驗結果

2.2.1響應面法試驗結果及方差分析

響應面試驗設計是在單因素試驗的基礎上進行優化的設計方案，采用極差分析對6組單因素水平進行篩選，最終選用初始pH（A）、發酵時間（B）、裝液量（C）3個因素為主要考察因素，SCP產量（Y）為考察指標進行響應面試驗，按響應面試驗設計進行發酵生產SCP，試驗設計與結果見表3，方差分析見表4。

表3　響應面試驗設計與結果Table 3　Designs and results of response surface methodology

表4　響應面試驗方差分析Table 4　Variance analysis of response surface methodology

應用Design Expert8.0.6軟件進行多元回歸擬合分析，得出發酵工藝各因素變量的二次方程模型為：Y=3.06+ 0.34A+0.18B-0.099C-0.051AB+0.29AC+0.090BC-0.50A2-0.48B2-0.37C2。

由表4方差分析可知，模型失擬項不顯著（P=0.074 1＞0.05），說明方程不失擬，回歸模型極顯著（P=0.001 1＜0.01），模型的相關系數R2為94.65%，說明該模型能夠較好的擬合實驗結果，因此回歸方程給黃漿水的發酵提供了一個合適的模型。從方差分析中還可以看出方程的一次項中pH對結果影響極顯著（P＜0.01）、發酵溫度對結果影響顯著（P＜0.05），而A2、B2、C2均對結果影響極顯著（P＜0.01）。這說明發酵時間、初始pH和裝液量這三個因素都是在發酵過程中需要主要控制的因素。模型AB交互項影響顯著，而BC、AC之間的交互作用均不顯著。

2.2.2黃漿水發酵生產SCP的響應面分析

響應面圖形能直觀地反映各因素及其交互作用對響應值的影響，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面圖及其等高線見圖1。

從各因素之間兩兩相互作用的響應面圖形觀察，各因素間有較為強的交互作用，發現其中曲線走勢越陡，其影響越顯著；曲線走勢越平滑，其影響越小。由圖1可知，三個響應因素在選定的范圍內都存在極值，其中AB交互作用顯著，BC、AC交互作用不顯著，經過響應面得到優化的結果為初始pH6.34、發酵時間43.03 h、裝液量140.36 mL/250 mL。

續表

圖1　初始pH、發酵時間、裝液量的交互作用對單細胞蛋白產量影響的響應面和等高線圖Fig.1　Response surface plots and contour line of effects of interaction among initial pH,fermentation time and liquid volume on single cell protein production

2.3響應面驗證試驗

利用Design-expert 8.0.6軟件進行響應面試驗，通過優化得知，初始pH為6.34，發酵時間為43.03 h、裝液量為140.36 mL/250 mL，經過軟件分析得到的最佳SCP理論產量為3.32 g/100 mL。為了檢驗模型預測的準確性，考慮實際操作性，在初始pH為6，發酵時間為42 h、裝液量為140 mL/250 mL條件下進行發酵驗證。經過3次的重復性驗證試驗，測得SCP平均值為3.28 g/100 mL，與模型較吻合，說明該模型可以較好地預測發酵情況，具有實際的應用價值。

3　結論

我國豆制品種類豐富，年產量大，導致生產過程中的黃漿水產量很大，目前大采用的生化方式來處理，投資大且效果不理想。通過利用生物法發酵生產SCP以替代傳統的飼料，同時降低黃漿水中的COD、BOD等污染成分。本試驗利用響應面法研究黃漿水發酵SCP的工藝，以求有效的解決廢水排放的問題，提高資源利用率。

本試驗通過初步對初始pH、C/N、接種量、發酵溫度、發酵時間、裝液量等6個因素試驗并進行極差分析，經過分析篩選得到3個顯著因子，分別為初始pH、發酵時間、裝液量。利用篩選出的因素進行響應面試驗，最終得到發酵最佳工藝為：C/N為5、初始pH6、裝液量140 mL/250 mL、接種量6%、發酵溫度28℃、發酵時間42 h，最終經過響應面優化及驗證試驗得到SCP最高產量為3.28 g/100 mL。

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Optimization of fermentation process of yellow slurry water for single cell protein production by response surface method

CHE Yingjie,HAO Lin*
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

Using yellow slurry water as raw material,Geotrichum candidum,Endomycopsis fiburiger,Candida lipolytica,andCandida utilis(2∶1∶1∶2) were selected as fermentation strains to ferment yellow slurry water.On the basis of single factor experiments,the fermentation process of yellow slurry water for single cell protein(SCP)production was studied by response surface experimental design method.The results showed that the factors affecting SCP production in order were:initial pH,fermentation time,liquid volume.The optimal extraction technology was C/N 5,initial pH 6,liquid volume 140 ml/250 ml,inoculum 6%,fermentation temperature 28℃and time 42 h.Under the optimized condition,the highest SCP production reached 3.28 g/100 ml.

yellow slurry water;single cell protein;response surface method;hydrolyzed corn starch

TQ920.9

0254-5071（2016）10-0091-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.020

2016-05-27

企業橫向聯合項目

車穎潔（1992-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

郝林（1957-），男，教授，博士，研究方向為食品微生物學。