CD4+CD25+調節性T細胞與Th17細胞在尋常型銀屑病中的表達

張玉麗王逸飛張春敏

CD4+CD25+調節性T細胞與Th17細胞在尋常型銀屑病中的表達

張玉麗1王逸飛2張春敏3

目的: 檢測外周血中CD4+CD25+調節性T細胞(簡稱Treg細胞)與Th17細胞在尋常型銀屑病(PV)中的表達。方法: 34例尋常型銀屑病患者，18例正常人作為對照。采用流式細胞術檢測外周血中Treg細胞、FOXP3+Treg細胞及Th17細胞的表達水平。結果: PV患者外周血中Treg細胞比例和FOXP3+Treg細胞比例分別為(3.68±1.22)%和(0.53±0.19)%，低于正常對照組的(6.63± 1.00)%和(0.76±0.14)%(P＜0.05)。Th17細胞比例為(2.20±0.78)%，高于正常對照組的(0.65± 0.22)%(P＜0.05)。PV患者外周血中Treg細胞的表達與FOXP3+Treg細胞的表達呈正相關(r＝0.563，P＜0.05)，而Treg細胞的表達與Th17細胞的表達呈負相關(r＝-0.522，P＜0.05)；Treg細胞和Th17細胞二者與PASI評分無相關性，與病程亦無相關性。結論: Treg細胞表達的減少及Th17細胞應答的增強，可能是導致PV免疫失衡的重要原因。

尋常型銀屑病； CD4+CD25+調節性T細胞； Th17細胞； Foxp3； PASI評分； 流式細胞術

目前，尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris，PV)的發病機制尚不清楚，尤其是功能紊亂的效應性T細胞是如何被活化和維持活化狀態的機制尚不明確。CD4+T細胞的兩個新亞型CD4+CD25+調節性T細胞(簡稱Treg細胞)和Th17細胞是近年來的研究熱點。研究表明Treg、Th17細胞與多種自身免疫性疾病發病密切相關[1，2]。Treg細胞具有免疫抑制和免疫調節兩大功能，是機體維持自身免疫耐受的重要組成部分[3]，而新近發現的Th17細胞則是一種重要的促炎性細胞，可通過分泌IL-17誘導多種前炎癥細胞因子和趨化因子的釋放，參與機體炎癥反應[4]。目前檢測PV患者外周血中Treg細胞和Th17細胞的比較與分析的報道較少。故本研究中利用流式細胞術，擬對34例PV患者和18例對照組的外周血中Treg細胞和Th17細胞的水平進行比較分析，為探討Treg細胞和Th17細胞在PV免疫學發病機制中的作用進行初步嘗試。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 流式細胞儀購自美國BD公司，人調節性T細胞熒光抗體標記試劑盒(包括FITC抗人CD4、PE抗人CD25、PE-Cy5抗人Foxp3、同型對照抗體PE-Cy5 Rat IgG2a及Fixation/Permeabilization等)和刺激劑Cell Stimulation Cocktaul購自ebioscience公司；FITC抗人CD3抗體、PerCP抗人CD8a、PE抗人IL-17A抗體及同型對照購自BioLegend公司；刺激劑、人淋巴細胞分離液購自TBD公司；RP-MI1640培養液購自Gibco公司、小牛血清購自四季青；破膜劑FIX＆PERM Kit購自MultiSciences公司。

1.2 研究對象 選擇2011年6～10月我院門診確診為PV的患者34例，男18例，女16例，年齡19～62歲，平均(36.3±16.7)歲，病程10天～21年，均為PV的進行期，銀屑病患者的皮損面積和嚴重程度按PASI評分為7.6～22.3分，平均(13.5±3.8)分。就診前一個月未使用糖皮質激素和免疫抑制劑；同時從健康體檢中心選取18名正常人作為對照，其中男10名，女8名，年齡20～64歲，平均(40.0±14.2)歲，且一個月內無細菌、真菌、病毒感染，既往無銀屑病等免疫相關皮膚疾病史。兩組在性別、年齡上無統計學差異(P＞0.05)。所有受試對象均知情同意并經醫院學術倫理委員會討論通過。

1.3 Treg細胞的檢測 取新鮮采集的肝素鈉抗凝血100μL，加入CD4-FITC和CD25-PE 20μL，4℃避光孵育30 min，緩沖液洗滌1次，加入1 mL破膜劑4℃避光45 min，洗滌2次，加入2μL溶血素4℃避光15 min后加入FoxP3-PE-Cy5、IgG2a-PE-Cy54℃避光30 min，緩沖液洗滌2次，用適量的緩沖液固定，24 h內上流式細胞儀檢測。以CD4、CD25設門區分出CD4+CD25+細胞，再測定Foxp3+細胞并以散點圖表示，以熒光抗體染色陽性細胞的百分比記錄結果。

1.4 Th17細胞的檢測 外周血單個核細胞(PBMC)懸液(2×106mL-1)加入24孔培養板內，每孔1mL，加入刺激劑，置培養箱中培養5 h(37℃，5%CO2)。搜集細胞于離心管中，離心棄上清后加入500μL破膜劑，4℃孵育15 min，離心棄上清，收集細胞后分為同型對照管和實驗管，分別加入PerCP-CD8a Antibody 5μL，FITC-CD3 20μL，PE-IgG1 5μL，PE-IL-17A 20μL，4℃避光30 min。PBS洗滌后重懸細胞于300 μL洗滌液中，24 h內上流式細胞儀檢測。以CD3/ CD8直方圖設門區分出CD3+/CD8-細胞，以散點圖表示IL-17+細胞，即CD3+CD8-IL-17+細胞群來代表Th17細胞，以熒光抗體染色陽性細胞的百分比記錄結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件對所有數據進行統計學分析，組間比較采用獨立樣本T檢驗，數據以(ˉx±s)表示；P＜0.05為有統計學意義；Treg細胞、Foxp3+Treg細胞和Th17細胞的表達水平之間以及與PASI評分、病程的相關性，采用直線相關分析(Pearson)進行分析，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血Treg細胞、Foxp3+Treg細胞比例的檢測通過流式細胞儀對細胞表面標志及細胞內因子的檢測顯示，PV患者外周血中Treg細胞的比例為(3.68 ±1.22)%，低于正常對照組(6.63±1.00)%，差異具有統計學意義(P＜0.05)，其中Foxp3+Treg細胞的比例為(0.53±0.19)%，低于正常對照組(0.76±0.14)%，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 外周血Th17細胞比例的檢測 通過流式細胞儀對細胞表面標志及細胞內因子的檢測顯示，PV患者外周血中Th17細胞比例為(2.20±0.78)%，高于正常對照組(0.65±0.22)%，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 尋常型銀屑病組和正常對照組Treg、Foxp3+Treg與Th17細胞的表達率比較 (ˉx±s，%)

2.3 相關性分析 PV患者外周血中Treg細胞的比例與Foxp3+Treg細胞的表達呈正相關(r＝0.563，P＜0.05)，而外周血Treg細胞的比例與Th17細胞的比例呈負相關(r＝-0.522，P＜0.05)；外周血中Treg細胞、Th17細胞的比例與PASI評分無相關性(r值分別為0.021、0.080，P＞0.05)，二者與病程亦無相關性(r值分別為0.085、0.178，P＞0.05)。

3 討論

銀屑病發病機制一直是研究的熱點。目前認為其發病核心是細胞免疫紊亂，尤其與T細胞密切相關[5]。Treg細胞與Th17細胞均由初始CD4+T細胞分化而來。Treg細胞可由胸腺內發育成熟后直接遷移到外周，也可由外周初始T細胞(Th0)經TGF-β等細胞因子的誘導分化而來，Foxp3是轉錄因子 forkhead/winged helix家族的新成員，稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子，它不僅是Treg細胞的重要標志，而且也參與Treg細胞的分化與功能。Treg細胞通過分泌細胞因子或細胞接觸兩種方式發揮免疫抑制和免疫調節作用，在維持自身免疫耐受中發揮重要作用；小鼠Th17由初始CD4+T細胞在TGF-β和IL-6等細胞因子的誘導下分化而來(人Th17則由IL-1β和IL-6共同誘導)。Th17細胞則是一種重要的促炎性細胞，其高表達IL-17，同時也分泌IL-6和TNF-α，其中IL-17是 Th17的標志性細胞因子，具有強大的致炎性[6]，Th17細胞具有不同于其它細胞亞群的獨立的分化和發育調節機制，在感染性疾病和自身免疫性疾病中發揮著重要的調節作用。

銀屑病是一種在一定遺傳背景下，效應性T細胞介導的免疫紊亂性炎癥性皮膚病[7]。由于免疫反應中Treg細胞功能與效應性細胞功能之間的平衡對免疫反應的維持非常重要，而銀屑病的病理特點就是自身反應性T細胞的持續激活，提示尋常型銀屑病可能有Treg細胞功能的障礙。Sugiyama等[8]研究發現PV患者外周血和皮損中Treg細胞不僅數目明顯低于正常人，而且還存在增殖缺陷，Bovenschen[9]等認為，在外周血中，Treg細胞的數量與正常人相似，但其對效應T細胞的抑制功能明顯減弱，陳凌等[10]研究發現，銀屑病外周血中Treg細胞不僅比例明顯減少，而且其功能也有所降低，不能很好的抑制效應T細胞的擴增和功能。本研究結果顯示，PV患者Treg細胞和Foxp3+Treg細胞在人外周血中的表達顯著低于正常人，這與陳凌研究結果是一致的。并且Treg細胞的表達水平與Foxp3+Treg細胞的表達水平呈正相關，因此我們認為，可能由于Foxp3+Treg細胞數量減少或功能的降低，導致整個Treg細胞表達水平的降低，使得Treg細胞的免疫抑制和免疫調節功能受到抑制或破壞，導致抑制炎癥反應的作用低于正常水平，導致PV的發生。

Capron等[11]的研究結果表明，在中、重度斑塊型銀屑病的患者外周血中，IL-17表達水平明顯增高，且與PASI評分呈線性正相關，LI等[12]實驗證明:銀屑病患者皮損中IL-17mRNA及Th17細胞相關因子IL-23p19、IL-23p40、IL-6 mRNA含量顯著高于患者非皮損處。IL-23是IL-17大量產生的重要細胞因子；IL-6不僅是Th17細胞分泌的炎性介質，同時IL-6又能劑量依賴性促進IL-17的分泌，這種正反饋作用可能參與銀屑病等慢性炎癥的惡化。本研究結果顯示，與正常人比較，PV患者外周血中Thl7細胞的表達率顯著增加。由此我們推測Th17細胞可能通過IL-17的促炎效應，或通過其分泌的細胞因子誘導其它細胞產生致炎因子，加重機體的病理性免疫應答反應，參與并促進PV的發生發展。

Beriou等[13]研究發現一群 Foxp3+RORγt+T細胞，這群細胞在炎癥反應發生之前就存在著，并抑制T細胞的抗炎癥效應，而一部分記憶性Foxp3+Treg細胞高表達Th17細胞的特異性標記RORγt，分泌IL-17，并且其表型與功能和Th17細胞出現部分重合。這表明Treg在某些特定微環境中可能存在著細胞轉化。本研究結果顯示，PV患者外周血中Treg細胞表達低于正常對照組，而Th17細胞表達高于正常對照組，并且我們的實驗研究已證實Treg細胞占CD4+T細胞的比例與Th17細胞占CD4+T細胞的比例呈負向相關，由此我們推測由于Treg細胞和Th17細胞之間的平衡發生了紊亂，且明顯向Th17方向偏移；Treg細胞數量的減少或功能的降低，不足以抑制Th17細胞的過度活化，導致PV的發生或加重。

Treg細胞和Th17細胞的分化存在著密切聯系，有研究者認為機體內除了Th1/Th2平衡外，還存在Th17/Treg平衡[14]。Th17/Treg失衡可加重疾病的炎癥反應。本實驗結果顯示，在PV患者外周血中Treg細胞表達減少，Th17細胞應答增強，并且二者成負相關，可能是導致PV免疫失衡的重要原因。

[1]Boissier MC，Assier E，Falgarone G，et al.Shifting the imbalance From Th1/Th2 to Thl7/treg:the changing rheumatoid arthritis paradigm[J].Joint Bone Spine，2008，75(4):373-375.

[2]Leeta J，Gomariz RP，Martinez C，et al.Vasoactive intestinal peptide regulates Th17 function in autoimmune inflammation[J]Neuroimmunomodulation，2007，14(3-4):134-138.

[3]Shevach EM.Certified professionals:CD4+CD25+suppressor T cells[J].JExp Med，2001，193(11):41-46.

[4]Annunziato F，Cosmi L，Santarlasci V，et al.Phenotypic and functional features of human Th17 cells[J].J Exp Med，2007，204(8):1849-1861.

[5]LiX，Fan X，Zhang K，etal.Influenceof paoriatic peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes on C-myc.B CL-Xl and Ki67 gene expression in keratinocytes[J].Eur JDermatol，2007，17(5):392-396.

[6]Romagnani S.Human Th17 cells[J].Arthritis Research＆Therapy，2008，10(2):206.

[7]Mehlis SL，Gordon KB.The immumology of psoriasis and biologic immunotherapy[J].J Am Acad Dermatol，2003，49 (2Suppl):S44-50.

[8]Suqiyama H，Gyulai R，Toichi E，et al.Dysfunctional blood and target tissue CD4+CD25highregulatory T cells in psoriasis:mechanism underlying unrestrained pathogenic effector T cell proliferation[J].J Immunol，2005，174(1):164-173.

[9]Bovenschen HJ，van Vlijmen-Willems IM，van de Kerkhof PC，et al.Identification of lesional CD4+CD25+Foxp3 regulatory T cells in psoriasis[J].Dermatology，2006，213(2): 111-117.

[10]陳凌，沈柱，伍津津，等.不同病程尋常型銀屑病患者外周血中CD4+CD25high調節性T細胞的比較與分析[J].細胞與分子免疫學雜志，2007，23(10):939-940.

[11]Caproni M，Antiqa E，Melani L，et al.Serum levels of IL-17 and IL-22 are reduced by etanercept，but not by acitretin，in patients with psoriasis:a randomized-controlled trial [J].JClin Immunol，2009，29(2):210-214.

[12]Li JW，Chen XE，Liu ZX，et al.Expression of Th17 cytokines in Skin Lesions of Patientswith Psoriasis[J].JHuazhong Univ Sci Technol，2007，27(3):330-332.

[13]Beriou G，Costantino CM，Ashley CW，et al.IL-17-producing human peripheral regulatory T cells retain suppressive function[J].Blood，2009，113:4240-4249.

[14]Bettelli E，CarrierY，GaoW，etal.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector Th17 and regulatory T cells[J].Nature，2006；411(7090):235-238. (收稿:2016-05-15 修回:2016-06-17)

·病例報告·

圖1 下肢水皰，丘疹，結痂 圖2 足部白色丘疹樣瘢痕 圖3 棘層變薄，真皮淺層血管增生，輕度單一核細胞浸潤(HE，×100) 圖4 表皮細胞間及基底膜IgG、C3、IgM、IgA陰性(DIF，×100)

圖5 雙下肢米粒至黃豆大小丘疹，水皰 圖6 結痂以及瘢痕 圖7 表皮輕度角化過度及萎縮，裂隙形成，基層液化周圍少許單一核細胞(HE，×100)

參考文獻

[1]趙辨.中國臨床皮膚病學[M].南京:江蘇科學技術出版社，2009.1467.

[2]Odom RB，James WD，Berger TG.Andrews Diseases of the Skin Clinical Dermatology[M].9th Edition，Science Press， 2001.696.

[3]趙慶利，王南，史飛，等.維生素E、維胺酯膠囊聯合治療白色丘疹樣大皰性表皮松解癥1例[J].中國皮膚性病學雜志，2005，19(1):30-31.

[4]劉雄彪，程琦，葉紅.白色丘疹樣營養不良型大皰性表皮松解癥一家系報告[J].中國皮膚性病學雜志，2004，18 (10):618-619.

[5]李干群，陳靜.白色丘疹樣型大皰性表皮松解癥三代5例[J].湖南醫學，2000，1:80-81.

[6]文海泉，周君.白色丘疹樣型大皰性表皮松解癥1例[J].中國麻風皮膚病雜志，2003，19(5):486-487.

[7]楊鯤鵬.白色丘疹樣營養不良型大皰性表皮松解癥1例[J].嶺南皮膚性病科雜志，2008，15(3):176-177.

(收稿:2014-03-30)

Role of CD4+CD25+regulatory T cells and Th17 cells in patients w ith psoriasis vulgaris

ZHANG Yuli1，WANG Yifei2，ZHANG Chunmin3.
1.Liaocheng People's Hospital，Liaocheng 252000，China；2.Shandong University School ofMedicine，Jinan 250014，China；3.The Second Hospital ofShandong University，Jinan 250033，China

Objective:To detect the expression of Treg cells and Th17 cells in the patientswith psoriasis vulgaris(PV).M ethods:Thirty-four PV and 18 healthy controlswere enrolled in the study，and Treg cells，Foxp3 and Th17 cells of the blood were detected by flow cytometry.Results:The percentage of Treg cells and Foxp3 cells were(3.68±1.22)%and(0.53±0.19)%，which were significantly lower than those in normal controls(6.63±1.00)%，and(0.76±0.14)%(P＜0.05).The percentage of Th17 cellswas(2.20±0.78)%，which was significantly higher than that in normal controls(0.65±0.22)%(P＜0.05).The expression of Treg cells and FOXP3+Treg cellswas positively correlated(r＝0.563，P＜0.05)，but the expression of Treg cells and Th17 cells was negatively correlated(r＝-0.522，P＜0.05).The correlationa mong Treg cells，Th17 cells，PASIscore and duration of the diseasewas not significant(P＞0.05).Conclusion:The decrease in the expression of Treg cells and the increased response of Th17 cellsmay be the important factors for the immunological imbalance in PV.

psoriasis vulgaris；regulatory T cells；Th17 cells；FOXP3；PASIscore；flow cytometry

1.聊城市人民醫院山東聊城，252000 2山東大學醫學院，山東濟南，250014 3山東大學第二醫院，山東濟南，250033

張春敏，E-mail:cmzhang1878@163.com