基于“分段”-“完整”轉(zhuǎn)化的G-四鏈體脫氧核糖核酸酶?jìng)鞲衅饔糜诙嗑酆塑账峒っ傅臋z測(cè)

周 璐 程 慧 王金娥 裴仁軍

(中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所，蘇州 215123)

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基于“分段”-“完整”轉(zhuǎn)化的G-四鏈體脫氧核糖核酸酶?jìng)鞲衅饔糜诙嗑酆塑账峒っ傅臋z測(cè)

周 璐 程 慧 王金娥 裴仁軍*

(中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所，蘇州 215123)

多聚核苷酸激酶； 脫氧核糖核酸酶； G-四鏈體； 生物傳感器

1 引 言

T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)是Richardson于1965年研究T4噬菌體侵襲大腸桿菌的過程中發(fā)現(xiàn)的[1]。T4 PNK酶可以催化ATP的γ-位或3′-單磷酸核苷的磷酸基團(tuán)與寡核苷酸鏈(雙鏈DNA和單鏈DNA或RNA)的5′-羥基基團(tuán)進(jìn)行轉(zhuǎn)移和交換，實(shí)現(xiàn)寡核苷酸的5′磷酸化或者3′去磷酸化，在基因克隆、載體制備和核酸的損傷與修復(fù)中具有非常重要的作用[2]。因此，發(fā)展快速、簡(jiǎn)單、靈敏的分析方法用于檢測(cè)T4 PNK在核酸代謝和分子靶向治療等研究領(lǐng)域具有重要的實(shí)際意義。

近年來，在放射性同位素32P標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影等傳統(tǒng)檢測(cè)方法[3,4]的基礎(chǔ)上，發(fā)展了一些快速檢測(cè)T4 PNK的新方法。這些方法主要基于分子信標(biāo)技術(shù)[5]、發(fā)夾型熒光探針技術(shù)[6]、氧化石墨烯淬滅技術(shù)[7]、金納米粒子顯色技術(shù)[8]以及電化學(xué)檢測(cè)[9]等，以實(shí)現(xiàn)對(duì)T4 PNK的快速檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Lambda 25 紫外-可見分光光度計(jì)(PerkinElmer公司) ，測(cè)量時(shí)使用微量樣品池；Biophotometer 核酸蛋白儀(Eppendorf公司)；ChirascanTM-plus 圓二色光譜儀(Applied Photophysics公司)。

實(shí)驗(yàn)中所用到的寡核苷酸鏈：S1OH(5′-GTGGGTCATTGT-3′)、S2OH(5′-GGGTGG GTGTGG-3′)、PS5.M(5′-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG-3′)、5H8(5′-ACCCACACAA-3′)、5H10(5′-CACCCACACAAT-3′)、5H12(5′-CCACCCACACAATG-3′)、5H14(5′-CCCACCCACACAATGA-3′)、5H16(5′-ACCCACCCACACAATGAC-3′)及5H18(5′-CACCCACCCACACAATGACC-3′)均由上海生工生物技術(shù)有限公司定制合成。其濃度通過測(cè)量260 nm處的吸光度值及相應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算得到。每條寡鏈核苷酸鏈的摩爾吸光系數(shù)由網(wǎng)站(http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/ OligoAnalyzer)提供的軟件計(jì)算得出。配制的寡鏈核苷酸儲(chǔ)備液分裝后于-20℃保存。

4-羥基乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，NaOH、NaCl、KCl、曲拉通-100(Triton X-100)和H2O2(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。T4 多聚核苷酸激酶(T4 PNK，10 U/μL)、10×T4 PNK反應(yīng)緩沖液A、T4 DNA連接酶(10 U/μL)、10×T4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液(Thermo公司)。核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ，200 U/μL)，10×Exo Ⅲ反應(yīng)緩沖液(Takara公司)。5′-三磷酸腺苷二鈉鹽(ATP二鈉鹽)、氯化血紅素(Hemin)和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)購(gòu)自Sigma公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ cm)。

2.2 T4 PNK 磷酸化實(shí)驗(yàn)

每個(gè)樣品的反應(yīng)總體積為2.0 μL：其中含20.0 μmol/L鏈S2OH，1×T4 PNK 緩沖液A，1 mmol/L ATP，T4 PNK分別為 0.02，0.05，0.08, 0.1，0.2, 0.3，0.5，1.0，2.0和5.0 U/mL，其余由滅菌水補(bǔ)齊。將樣品均勻混合后，置于37℃水浴中反應(yīng)30 min，再置于75℃水浴中失活10 min，冷卻至室溫，進(jìn)行下一步DNA雜交實(shí)驗(yàn)。

2.3 DNA 雜交實(shí)驗(yàn)

DNA雜交實(shí)驗(yàn)總體積為17 μL：其中T4 PNK實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)后的樣品2.0 μL，鏈S1OH(20 μmol/L)2.0 μL，鏈Helper DNA(20 μmol/L)2.0 μL，10×T4 連接酶反應(yīng)緩沖液2.0 μL，其余由滅菌水補(bǔ)齊。將樣品混勻后置于95℃水浴中5 min，再緩慢降至室溫，進(jìn)行下一步連接酶實(shí)驗(yàn)。

2.4 連接酶實(shí)驗(yàn)

連接酶實(shí)驗(yàn)樣品的總體積為20 μL：向上述DNA雜交實(shí)驗(yàn)的樣品(17 μL)中加入ATP(10 mmol/L)1.0 μL，T4 DNA 連接酶2.0 U/mL。將樣品混勻后置于22℃水浴中1 h，再置于75℃的水浴中10 min后，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.5 核酸外切酶Ⅲ實(shí)驗(yàn)和吸收信號(hào)檢測(cè)

核酸外切酶Ⅲ實(shí)驗(yàn)樣品的總體積為30 μL：向上述連接酶實(shí)驗(yàn)的樣品(20 μL)中加入10×Exo Ⅲ反應(yīng)緩沖液3.0 μL，溶液中Exo Ⅲ酶終濃度為2.0 U/mL，最后由滅菌水補(bǔ)齊，將樣品混勻后置于37℃水浴中30 min，再置于75℃的水浴中10 min后，用于下一步吸光度測(cè)量。

吸光度信號(hào)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的樣品總體積為40 μL：向上述核酸外切酶Ⅲ實(shí)驗(yàn)的樣品(30 μL)中加入各物質(zhì)，使終濃度為H2O24.0 mmol/L，Hemin 2.0 μmol/L，KCl 40 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，Triton X-100，0.008%和ABTS 1.0 mmol/L，由HEPES緩沖液(20 μmol/L，pH 8.0)補(bǔ)齊體積。其中ABTS在測(cè)量前加入，混勻后迅速測(cè)量樣品的吸光度。

UV-Vis分光光度計(jì)的掃描波長(zhǎng)范圍為400～500 nm，掃描速度為240 nm/min，取418 nm處的吸光度值繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回收率。

2.6 圓二色(CD)光譜檢測(cè)

按2.2～2.5節(jié)完成每個(gè)步驟反應(yīng)，其中Helper DNA的鏈長(zhǎng)度為8～18堿基。用1 cm光路比色皿在235～320 nm范圍內(nèi)測(cè)定圓二色光譜，平均掃描3次，掃描速度為100 nm/min，響應(yīng)時(shí)間為1 s，帶寬為0.1 nm。

2.7 實(shí)際樣品中T4 PNK及回收率檢測(cè)

選擇Hela細(xì)胞系和HEK 293細(xì)胞系作為實(shí)際樣本。所有細(xì)胞均用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)量為106個(gè)，通過液氮和37℃水浴中反復(fù)凍融3次，離心去除上層清液后，用1 mL PBS緩沖液洗3次，離心(10000 g，20 min)后，取上清液作為實(shí)際樣品，不需稀釋，取0.5 μL用于2.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)。

向?qū)嶋H的細(xì)胞樣品中添加0.05，0.1和0.2 U/mL的T4 PNK酶，進(jìn)行酶活力檢測(cè)，計(jì)算回收率。

3 結(jié)果與討論

3. 1 傳感器的設(shè)計(jì)原理

圖1 “分段”-“完整”轉(zhuǎn)化的G-四鏈體脫氧核糖核酸酶?jìng)鞲衅饔糜跈z測(cè)T4 PNK酶的傳感器設(shè)計(jì)原理Fig.1 Schematic representation of T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) detection method using split-to-intact G-quadruplex DNAzymeT4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)：核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)：T4 DNA 連接酶(T4 DNA ligase)；血紅素(Hemin)。

圖2 “分段”-“完整”轉(zhuǎn)化的G-四鏈體脫氧核糖核酸酶?jìng)鞲衅饔糜跈z測(cè)T4 PNK酶的傳感器的可行性空白：Hemin 2.0 μmol/L，H2O2 4.0 mmol/L，ABTS 1.0 mmol/L (a)；鏈S1OH，S2OH和；S1OH和S2OH(c)；鏈S1OH，S2P(S2OH 與T4 PNK 反應(yīng)后)和H14 與T4 DNA連接酶和Exo Ⅲ反應(yīng)后(d)；PS5.M(e)Fig.2 Feasibility verifying of T4 PNK detection method using split-to-intact G-quadruplex DNAzyme. Hemin 2.0 μmol/L，H2O2 4.0 mmol/L, 2,2-azino-bis-(3-ethylbenzthiazo-line-6-sulphonic acid (ABTS) 1.0 mmol/L in [4-(2-hydroxyethyl]piperazine-1-erhaesulfonic acid (HEPES) buffer (a); S1OH, S2OH and (b); S1OH and S2OH (c)； Strand S2P(S2OH reacted with 5.0 U/mL T4 PNK)-S1OH-H14 reacted with T4 DNA ligase and exonuclease Ⅲ (Exo Ⅲ) (d); Strand PS5.M (e)

3.2 Helper DNA的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[23]報(bào)道，如果形成的G-四鏈體的結(jié)構(gòu)為平行構(gòu)型時(shí)，在265 nm附近有一個(gè)正峰，在245 nm附近有一個(gè)負(fù)峰；而雙鏈DNA的CD光譜在245 nm附近有一個(gè)負(fù)峰，但是正峰的位置在260～280 nm，具體會(huì)隨序列不同而變化。對(duì)比圓二色光譜(CD)數(shù)據(jù)(圖4)與吸光度數(shù)據(jù)(圖3)可知，當(dāng)Helper DNA堿基數(shù)為8或10時(shí)，體系中形成的G-四鏈體的結(jié)構(gòu)的DNA很少，但是當(dāng)鏈Helper DNA堿基數(shù)為14時(shí)，在體系中很好地形成并釋放出PS5.M，在Hemin與K+存在下，形成了G-四鏈體結(jié)構(gòu)。

圖序列長(zhǎng)度的優(yōu)化。DNA的濃度為1.0 μmol/L，T4 PNK 5.0 U/mL，adenosine triphosphat (ATP) 1.0 mmol/L，T4 DNA連接酶2.0 U/mL，Exo Ⅲ 2.0 U/mL，Hemin 2.0 μmol/L，H2O2 4.0 mmol/L，ABTS 1.0 mmol/L，緩沖體系為HEPES緩沖液Fig.Ⅲ 2.0 U/mL, hemin 2.0 μmol/L, H2O2 4.0 mmol/L, ABTS 1.0 mmol/L, and the absorbance were measured in HEPES buffer.

圖4 不同長(zhǎng)度的鏈的CD光譜圖Fig.4 CD spectra of strands at different lengths

3.3 PNK反應(yīng)中ATP用量的優(yōu)化

ATP是T4 PNK催化DNA5′-端磷酸化的反應(yīng)物之一，其用量也會(huì)影響最終檢測(cè)的靈敏度，所以對(duì)ATP濃度進(jìn)行了優(yōu)化。從圖5可見，隨著ATP濃度的增加，體系的吸光度迅速增加；當(dāng)ATP濃度高于1 mmol/L后，吸光度增加緩慢，趨于平衡。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用1 mmol/L ATP。

3.4 傳感器用于檢測(cè)PNK

為了考察上述基于“分段”-“完整”G-四鏈體脫氧核糖核酸酶?jìng)鞲衅鲗?duì)T4 PNK活性的定量檢測(cè)的可行性，考察了不同濃度的T4 PNK酶與鏈S2OH反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間均為30 min。將反應(yīng)得到的樣品進(jìn)行上述雜交、T4 連接酶連接、Exo Ⅲ酶剪切和與Hemin作用催化H2O2氧化ABTS的反應(yīng)，測(cè)量體系在418 nm處吸光度的變化。如圖6所示，在0.02～0.3 U/mL濃度范圍內(nèi)，體系在418 nm處的吸收值與T4 PNK 的濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.6382x+0.3117 (R2=0.9945)，檢出限為0.014 U/mL(S/N=3)，與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的結(jié)果相當(dāng)。

3.5 傳感器用于檢測(cè)實(shí)際樣本中PNK

為了檢驗(yàn)此傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)效果，對(duì)Hela細(xì)胞系和HEK 293細(xì)胞進(jìn)行處理，測(cè)量了樣本中的T4 PNK酶的含量及加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。Hela和HEK 293細(xì)胞裂解液中均含有PNK 酶。采用本方法測(cè)得兩種細(xì)胞樣品PNK酶的濃度分別為0.0596和0.0271 U/mL，兩種細(xì)胞液中3個(gè) 濃度添加水平的PNK的回收率為95.6%～105.7%，表明本方法可以用于實(shí)際樣品中PNK活性的檢測(cè)。

表1 實(shí)際細(xì)胞樣品中T4 PNK的濃度及回收率測(cè)定

Table 1 Concentrations and recoveries of T4 PNK in real cell samples (n=3)

細(xì)胞樣品Cellsample加入量Added(U/mL)測(cè)定值Found(U/mL)回收率Recovery(%)HelaHEK29300.0596±0.00030.050.1084±0.001597.6±3.40.10.1653±0.0041105.7±8.60.20.2674±0.0082103.9±3.700.0271±0.00010.050.0787±0.0011102.9±2.20.10.1229±0.002295.6±2.50.20.2333±0.0051103.1±5.4

圖5 ATP濃度對(duì)PNK的磷酸化效率的影響Fig.5 PNK phosphorylation efficiency at different concentrations of ATP

4 結(jié) 論

圖6 傳感體系在418 nm的吸光度值與T4 PNK活性的關(guān)系，插圖為線性關(guān)系曲線Fig.6 Relationshio of absorbance of sensing system at 418 nm with T4 PNK activity, the inset is calibration curve

在K+存在下，G-四鏈體脫氧核糖核酸酶可與Hemin形成具有過氧化物酶性質(zhì)的復(fù)合物，可以催化H2O2氧化ABTS反應(yīng)，增強(qiáng)溶液的吸光度，據(jù)此構(gòu)建了T4 PNK活性檢測(cè)的傳感器。本傳感器設(shè)計(jì)巧妙，使用的寡核苷酸鏈無需標(biāo)記，無需昂貴的儀器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)T4 PNK酶的定量檢測(cè)，可望用于實(shí)際樣本中PNK的選擇性的靈敏檢測(cè)。

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(Received 11 June 2015; accepted 24 August 2015)

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31301495, 21275156, 21305154)

G-Quadruplex DNAzyme Biosensor for Quantitative Detection of T4 Polynucleotide Kinase Activity by Using Split-to-Intact G-Quadruplex DNAzyme Conversion

ZHOU Lu, CHENG Hui, WANG Jin-E, PEI Ren-Jun*

(SuzhouInstituteofNano-TechandNano-Bionics,ChineseAcademyofSciences,Suzhou215123,China)

T4 polynucleotide kinase; DNAzyme; Split-to-intact G-quadruplex; Biosensor

10.11895/j.issn.0253-3820.150480

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31301495, 21275156, 21305154)資助

2015-06-11收稿；2015-08-24接受

*E-mail: rjpei2011@sinano.ac.cn