一種枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元的制備

龔建剛，邵麗瑋，馮志華，趙國先*，郝艷霜，張一為

（1.河北農業大學食品學院，河北保定071000；2.河北省畜牧獸醫研究所，河北保定071000；3.河北農業大學動物科技學院，河北保定071000；4.天津市飼草飼料工作站，天津河西300210）

一種枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元的制備

龔建剛1，邵麗瑋2，馮志華3，趙國先3*，郝艷霜3，張一為4

（1.河北農業大學食品學院，河北保定071000；2.河北省畜牧獸醫研究所，河北保定071000；3.河北農業大學動物科技學院，河北保定071000；4.天津市飼草飼料工作站，天津河西300210）

為優化枯草芽孢桿菌與刺五加多糖合生發酵的條件，本試驗采用4×2因子試驗設計，篩選適宜的溫度（30、34、37、40℃）和轉速（120 r/min和170 r/min）；采用單因素試驗設計篩選接種量（1%、2%、4%、6%、8%）、裝液量（50、100 mL）和初始pH值（5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5）；根據菌液的活菌數和芽胞產率確定刺五加多糖的添加量（0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.6、4.8、6.4、8、10 mg/mL）及合生元的培養時間（24、36、48 h）。結果表明，種子液的培養時間為24 h，溫度為37℃、轉速為170 r/min，接種量為4%，250 mL錐形瓶中裝液量為50 mL，培養基初始pH值為7.0，刺五加多糖的添加量為1.6 mg/mL，合生元培養時間為36 h，把培養好的菌液按1 L菌液∶0.5 kg麩皮的比例用干燥細麩皮吸附，在45℃烘箱中烘干即得枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元。經檢測，其活菌數為5×109cfu/g左右。

枯草芽孢桿菌；刺五加多糖；合生元；制備

合生元又稱合生素或共生元，是“益生菌和益生元的混合制劑”（宋青龍，2007）?？莶菅挎邨U菌合生元是枯草芽孢桿菌和與其具有協同作用的益生元的組合?？莶菅挎邨U菌與益生元相輔相成，共同發揮作用，為胃腸道建立了一個良好的微生態環境，促進有益菌生長增殖，抑制有害菌生長，提高機體免疫力，增強保健功能，發揮預防治療疾病的效果（潘寶海和孫東巖，2012；邊連全等，2012）?？莶菅挎邨U菌合生元既可發揮枯草芽孢桿菌的細菌生理活性，又可選擇性增加這種菌的數量使益生作用更持久，并且具有高效性與無殘留性等優點，現已被廣泛應用于動物生產中。

本試驗旨在研究刺五加多糖-枯草芽孢桿菌體外合生發酵的條件進而制備微生物飼料添加劑，為合生元飼料添加劑的開發提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗時間和地點合生元的制備，于2013—2014年在河北農業大學動物科技學院和生命科學學院進行制備。

1.2 材料與設備枯草芽孢桿菌（ACCC11025，中國農業微生物菌種保藏管理中心）；刺五加多糖（陜西慈緣生物有限公司，純度50%）；LB培養基（北京雙旋微生物培養基制品廠；稱取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加入1000 mL蒸餾水中加熱溶解，調pH到7.0±0.1，分裝，115℃高壓滅菌20 min，備用）。

新型恒溫振蕩器（ZHWY-2112B，上海智城分析儀器有限公司）；722型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司制造）；凈化工作臺（SWCJ系列，蘇州安泰有限公司）；電熱恒溫培養箱（DH6000AB型，天津市泰斯特儀器有限公司）；250 mL錐形瓶。

1.3 試驗方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌生長曲線及種子液培養時間的確定用接種環將保存在試管斜面上的枯草芽孢桿菌挑取1環接種到含有50 mL LB培養基的250 mL錐形瓶中，在37℃、120 r/min的恒溫振蕩器中培養24 h，每隔2 h或者1 h取樣1次，在600 nm分光光度計下測定其菌懸液的吸光度OD值，同時取無菌的LB培養液作對照，每組3個重復。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線，確定種子液的培養時間。

1.3.2 培養溫度、轉速的確定采用4×2因子試驗設計，將活化后的枯草芽孢桿菌種子液以容量比1%的接種量接種于50 mL LB培養基中，置于不同溫度（30、34、37、40℃）和不同轉速（120 r/min、170 r/min）的恒溫振蕩器中培養。于2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24 h各取樣1次，測菌懸液的OD值，每組3個重復。以時間（h）為橫坐標，OD值為縱坐標繪制生長曲線，篩選適宜的溫度和轉速。

1.3.3 接種量、裝液量、初始pH值的確定采用單因素法篩選接種量、裝液量和初始pH值，具體方法如下：

在無菌操作臺中，分別按1%、2%、4%、6%和8%的接種量將活化后的枯草芽孢桿菌液接種于裝50 mL LB培養基的250 mL錐形瓶中，每個接種量3個重復，置篩選好的溫度、轉速的恒溫搖床中培養24 h，600 nm下測菌液的OD值（用無菌培養基調零），根據OD值的大小，確定接種量。

在無菌操作臺中，按1%接菌量將活化后的種子液接種于250 mL錐形瓶，分別裝有50 mL和100 mL的LB培養基，兩種裝液量各3個重復，同上培養、測定，根據24 h的OD值大小，確定裝液量。

將培養基在滅菌前用1 mol/L的NaOH或HCl調節pH值分別為5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，各培養基按50 mL的裝液量分裝入3個250 mL的錐形瓶中，115℃滅菌20 min。在無菌操作臺中，按1%接菌量接種種子液，同上培養后根據24 h的OD值大小，確定初始pH值。

1.3.4 刺五加多糖最適添加量和合生元最適培養時間的確定在基礎LB培養基中加入不同比例的刺五加多糖，使其濃度分別為：0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.6、4.8、6.4、8、10 mg/mL。將每個濃度的培養基分裝入250 mL錐形瓶中，115℃滅菌20 min后，備用。按上述篩選的培養條件接種后放進恒溫振蕩器中培養48 h，分別在24、36、48 h采樣，用平板計數法測菌液的活菌數，顯微鏡下觀察芽孢產率，每組數據設3個重復，根據菌液的活菌數和芽孢產率確定刺五加多糖的最適添加量及合生元最適培養時間。

1.3.5 刺五加多糖-枯草芽孢桿菌合生元產品的制備及活菌數的測定根據上述篩選的培養條件進行刺五加多糖-枯草芽孢桿菌發酵合生元的擴大培養。然后，將菌液用適量的麩皮吸附，45℃干燥成產品，用平板計數法測定產品的活菌數。

1.4 統計分析試驗數據用Excel進行整理，作圖；用SPSS 17.0進行數據分析，差異顯著者進行Duncan’s多重比較。表中數值表示為“平均值±標準差”，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌24 h的生長曲線及種子液培養時間的確定從圖1可以看出，枯草芽孢桿菌生長到24 h時菌液OD值與前幾個小時相比變化很小，即枯草芽孢桿菌處于生長的穩定期，此時菌液活菌數高，菌液濃度大，因此，24 h可以作為枯草芽孢桿菌種子液的培養時間。

圖1 枯草芽孢桿菌24 h的生長曲線

2.2 枯草芽孢桿菌培養溫度、轉速的篩選結果通過枯草芽孢桿菌在不同溫度、轉速條件下的24 h生長曲線（圖2）可以看出，該菌在37℃、170 r/min條件下生長良好，優于在其他溫度、轉速組合下的生長情況，因此培養枯草芽孢桿菌的最佳溫度、轉速組合為37℃、170 r/min。

圖2 枯草芽孢桿菌在不同溫度、轉速下的24 h生長曲線

2.3 接種量、裝液量、初始pH值的確定由表1可知，隨著接種量的提高，24 h菌液的OD值逐漸增大，接種量為4%的OD值顯著高于2%（P＜0.01），但與6%的OD值差異不顯著（P＜0.05），再從節省接種量方面考慮，確定4%為適宜的接種量。

表1 枯草芽孢桿菌在不同接種量下生長24 h的OD值

由表2可知，裝液量為50mL時菌液的OD值明顯高于100 mL時菌液的OD值，因此確定適宜的裝液量為50 mL。

表2 枯草芽孢桿菌在不同裝液量中生長24 h的OD值

由表3可知，枯草芽孢桿菌在培養基初始pH值為5.5～8.5時，隨著pH值的增大24 h菌液的OD值逐漸增大，pH值在7.0以后隨著pH值的增大，菌液的OD值反而降低。pH值為7.0時OD值極顯著高于pH值為6.5時的OD值（P＜0.01），與pH值為7.5的差異不顯著（P＜0.05），同時考慮節省酸堿用量，因此確定適宜的初始pH值為7.0。

表3 枯草芽孢桿菌在不同初始pH的培養基中生長24 h的OD值

2.4 刺五加多糖最適添加量和合生元最適培養時間的確定按1.3.4的試驗條件及步驟培養枯草芽孢桿菌，分別在24、36、48 h采樣，平板計數法測活菌數，結果見表4。

表4 枯草芽孢桿菌在不同刺五加多糖濃度和不同培養時間下的活菌數cfu/mL

由表4可知，低濃度刺五加多糖促進枯草芽孢桿菌生長，高濃度抑制其生長，刺五加多糖濃度為1.6 mg/mL時，生長36 h菌液中枯草芽孢桿菌的活菌數最高，為3.3×109cfu/mL。

由顯微鏡下結果可知，枯草芽孢桿菌在0 mg/mL的刺五加多糖培養基中培養36 h時幾乎無芽孢，在1.6 mg/mL刺五加多糖培養基中培養36 h時芽孢率在90%以上。

2.5 枯草芽孢桿菌合生元產品的制備及其活菌數的檢測把培養好的菌液按1 L菌液∶0.5 kg麩皮的比例用干燥細麩皮吸附，在45℃烘箱中烘干即得枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元。利用平板計數法對枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元活菌數進行檢測，結果為5×109cfu/g左右。

3 討論

3.1 本試驗篩選益生菌和益生元的依據合生發酵技術即通過添加特定的一種或者多種益生元為底物對益生菌進行發酵，從而顯著增強菌株活力，縮短菌株生長周期，提高菌體增殖速度；其中部分益生元被益生菌利用后轉化為寡糖等物質，通過各自的代謝活動而有利于對方，從而更大化發揮合生元的潛力（潘寶海和孫東巖，2012）。合生元效果，首先取決于是否選了一個好菌種，再次取決于是否選對了與益生菌具有協同作用的益生元。為了確保本試驗研制的合生元產品的質量效果，遵循菌種選擇原則，選擇了具有良好的益生功能，能在低pH和膽汁中存活并能植入腸黏膜，安全性好，耐高溫、高壓，易加工、貯存等優良特性（翟玲，2009；劉文波，2000），且具有調節腸道菌群平衡、增強動物免疫力、提高生產性能等諸多功能的枯草芽孢桿菌作為合生元的益生菌菌種。本課題組經過前期摸索，尋找到了一種與枯草芽孢桿菌具有協同作用的中草藥提取物——刺五加多糖，最后通過合生發酵技術研制出枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元。

3.2 本試驗篩選發酵條件的依據合生元具有同時發揮益生菌與益生元的雙重作用的功能特點，一方面通過直接增加腸道有益菌數量來改善宿主腸道微生態平衡，達到宿主機體保健或疾病預防的目的；另一方面通過益生元促進有益菌增殖、增強動物對腸內有害微生物的抑制作用及非特異性免疫功能來強化腸道固有有益菌的作用效果（王振國，2009）。本試驗為了提高枯草芽孢桿菌數量及活性，對實驗室條件下制約枯草芽孢桿菌生長的主要培養條件進行了篩選，通過繪制枯草芽孢桿菌24 h的生長曲線并比較24 h時菌液的OD值，確定了枯草芽孢桿菌適宜的培養溫度為37℃，搖床轉速為170 r/min，接種量為4%，250 mL錐形瓶的裝液量為50 mL，培養基的初始pH值為7.0。篩選以上條件的依據如下：

首先，菌液的活菌數與菌液的OD值成一定的正相關關系。文宇婷（2012）研究表明，黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元菌液中的活菌數與其OD值（425 nm）呈良好的線性相關，標準曲線為y=465.321x-81.61，R2=0.948，用600 nm波長與425 nm波長測出的不同濃度的菌液OD值變化趨勢相同，但在600 nm波長下可以測更大濃度的菌液，因此我們通過比較600 nm下菌液的OD值來篩選枯草芽孢桿菌培養條件。

其次，溫度可以通過改變酶反應速率來影響菌體的生長，溫度過低抑制酶促反應速率及菌體代謝水平，溫度過高又會引起酶類失活，菌體迅速衰老，導致活菌數大幅度降低；搖床轉速不同對枯草芽孢桿菌的活菌數也有影響，轉速可能與菌液與氧接觸頻率有關。搖床本身可以控制溫度、轉速兩個影響因素，因此本試驗設置30、34、37、40℃4個不同溫度值，120、170 r/min 2個不同轉速值，進行不同組合試驗，最后發現在37℃和170 r/min的組合下，枯草芽孢桿菌生長最好。

再次，接種量、裝液量和培養基初始pH值對枯草芽孢桿菌的生長都有一定的影響（張麗霞，2006）。接種量的多少與菌株生長周期的長短有關。接種量過低，延滯期變長，造成培養周期延長，耗費大量時間；接種量過高，細菌對營養成分的競爭力過大，造成菌體因營養供應不足而提前死亡，同樣會抑制活菌數的增長，本試驗從菌液活菌數和節約種子液綜合考慮，選擇4%的接種量。裝液量的大小會影響搖瓶內溶氧量的變化，本試驗在250 mL的錐形瓶中分別裝50 mL和100 mL的培養基進行比較，發現裝50 mL培養基的菌液濃度高，可能裝100 mL培養基的錐形瓶中的溶氧量相比裝50 mL培養基不能滿足枯草芽孢桿菌生長的需要。pH值通過影響菌體細胞膜電荷、膜滲透性以及營養物質離子化的程度，而影響菌體對養分的吸收（張麗霞，2006）。由于搖瓶過程中的pH值難以控制，只能控制培養基的初始pH值。初始pH值的變化對于枯草芽孢桿菌生產發酵過程的影響非常顯著（黃秀梨和夏立秋，2000）。本試驗中枯草芽孢桿菌在培養基初始pH為5.5～8.5時，隨著pH的增大菌液OD值先增大后降低，趨勢與張媛媛等（2012）在復合益生菌芽孢桿菌發酵培養基及條件的優化試驗中pH對復合益生菌芽孢桿菌生長影響一致。

最后，植物多糖對益生菌生長一般有低濃度促進、高濃度抑制的趨勢，為了提高刺五加多糖對枯草芽孢桿菌的促生長作用及減少浪費，試驗對刺五加多糖的添加量設置了10個不同濃度。結果表明，在0～10.0 mg/mL枯草芽孢桿菌活菌數隨著刺五加多糖的濃度的提高先增加后降低，添加量為1.6 mg/mL時，枯草芽孢桿菌活菌數最高，這種活菌數隨著植物多糖添加量變化的趨勢與文宇婷（2012）和李樹鵬（2007）的報道一致。但在確定刺五加多糖的適宜添加量及合生元培養時間的依據上考慮到在實際生產中菌體形式的枯草芽孢桿菌產品活菌數下降的很快，因此以枯草芽孢桿菌活菌數和芽胞產率作為篩選合生元最佳培養時間的條件。結果表明，36 h時活菌數最高，芽胞產率達到了90%以上。

根據研究的菌種生物學特性，有針對地采用加工技術生產合生元制劑，防止產品失活、變質并使生產成本最低化，是生產過程中應考慮的重要問題之一（劉洪明，2009）。鑒于枯草芽孢桿菌對營養條件要求不高、耐受低pH值、不容易失活的特性，本試驗將發酵好的菌液以細麩皮作為載體進行吸附后在45℃烘干制成干燥的細粉狀產品，并聞到類似乳酸菌發酵制品典型的味道，符合對益生菌制劑產品的性狀檢測方面的要求（張日俊，2010）。另外，我國正式批準生產的微生物制劑中，對芽孢桿菌含菌量的規定為：5×108cfu/g（張日俊，2007）。本試驗枯草芽孢桿菌-刺五加多糖合生元的活菌數大約為5×109cfu/g，并且雜菌很少，完全達到了國家對微生物制劑含菌量的要求，可以說本產品加工工藝簡單、科學，易于推廣。

4 小結

在本試驗條件下，研制出了一種枯草芽孢桿菌-刺五加多糖發酵合生元，其制備參數為：種子液的培養時間為24 h，溫度為37℃、轉速為170 r/min，接種量為4%，250 mL錐形瓶中裝液量為50 mL，培養基初始pH值為7.0，刺五加多糖的添加量為1.6 mg/mL，合生元培養時間為36 h?？莶菅挎邨U菌-刺五加多糖合生元產品活菌數為5×109cfu/g左右。

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This experiment aimed to study the preparation of a kind of Bacillus subtilis-Acanthopanax polysaccharide synbiotics and optimize its preparation technology.A 4×2 factorial experiment design was used to selecte the appropriate temperature（30，34，37，40℃）and speed（120 r/min and 170 r/min）；Inoculation amount（1%，2%，4%，6%，8%），fluid volume（50，100 mL）and the initial pH value（5.5，6，6.5，7，7.5，8,8.5）was optimized by single factor experiment.According tomicrobialnumberoflivingbacteriumandsporeproductionrate，theacanthopanaxpolysaccharidecontent（0，0.4，0.8，1.6，2.4，3.6，4.8，6.4，8，10 mg/mL）and synbiotics incubation time（24，48，36 h）was determined.The results showed that the incubation time of seeds of liquid was 24 h，suitable temperature and speed was 37℃and 170 r/min，inoculation amount was 4%，250 mL conical flask containing fluid amounted to 50 mL，medium initial pH value was 7.0.A-canthopanax polysaccharide content was 1.6 mg/mL，synbiotics incubation time was 36 h.After incubation，bacterial liquid was adsorpted with the fine bran according to the proportion（1 L bacteria liquid∶0.5 kg bran）bran and baked in the oven at 45℃，plate count method was used to test the product on the number of living bacterium.The number of living bacterium of Bacillus subtilis-Acanthopanax polysaccharide synbiotics product was about 5×109cfu/g.

Bacillus subtilis；Acanthopanax polysaccharide；synbiotics；preparation

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161707

S816.3

A

1004-3314（2016）17-0023-04

河北省蛋雞體系（1004022）

*通訊作者