滇西橫斷山區家畜體表蜱類調查及鑒定

亞紅祥，沈 姝，蘇正元，鄧 菲，張云智

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滇西橫斷山區家畜體表蜱類調查及鑒定

亞紅祥1，沈 姝2，蘇正元2，鄧 菲2，張云智1

目的 調查滇西橫斷山區家畜體表蜱的種類。方法 采集家畜體表寄生的蜱蟲，經形態學鑒定后，用PCR法擴增蜱蟲樣本的16S rRNA、12S rRNA、COI、ITS2的基因片斷，測序后進行序列分析。結果 共采集成蟲蜱樣本1 874只，經形態學鑒定為1科、1屬(扇頭蜱屬Rhipicephalus)、4種，其中微小扇頭蜱(R.microplus)1 637只(占87.35%))，鐮形扇頭蜱(R.haemaphysaloides)218只(11.63%)，短小扇頭蜱(R.pumilio)11只(0.59%)，血紅扇頭蜱(R.sanguineus)8只(0.43%)。樣品分子鑒定結果與形態學鑒定結果一致。系統發育樹分析顯示，微小扇頭蜱Y2 16S rRNA、12S rRNA、COI、ITS2的基因序列分別與來自印度(EU918188)、貴州(KC503259)、馬來西亞(KM246873)、貴州(KC503274)的微小扇頭蜱在同一分支上，而與以往云南發現的微小扇頭蜱不在同一分支；鐮形扇頭蜱Y5的 16S rRNA、12S rRNA和COI基因序列分別與來自泰國(KC170743)、臺灣(DQ003005)和湖南(KM083593)的鐮形扇頭蜱在同一分支上；短小扇頭蜱Y6和Y01 的ITS2基因序列與來自澳大利亞的短小扇頭蜱(AF271282)在同一分支上。結論 滇西橫斷山區家畜體表蜱以微小扇頭蜱為優勢種，短小扇頭蜱為云南境內首次發現。

蜱；PCR檢測；序列分析；云南

蜱隸屬節肢動物門(Arthropoda)，蛛形綱(Arachnida)，蜱螨亞綱(Acari)，寄螨總目(Parasitiformes)，蜱目(Ixodida)。蜱目包括硬蜱科(Ixodidae)、軟蜱科(Argasidae)和納蜱科(Nuttalliellidae)，共計3科17屬899種[1]。中國發現蜱類2科(硬蜱科和軟蜱科)10屬119種[2]。蜱是許多細菌、病毒、立克次體、螺旋體和原蟲的傳播媒介和貯存宿主, 攜帶病原體的蜱叮咬人或動物后，可致使人或動物發病[3]，所引起的這類疾病統稱為蜱傳疾病。近些年，我國相繼發現了嗜吞噬細胞無形體[4]、新布尼亞病毒[5]、塔拉薩維奇立克次體[6]、勞氏立克次體[7]等新發蜱傳病原體及其所致疾病。當前，蜱和蜱傳疾病的危害已成為一個重大的社會公共衛生問題。云南省存在萊姆病、Q熱、森林腦炎、巴貝西蟲病等多種蜱傳疾病[8]，最近有人在云南扇頭蜱中發現了Nayun tick nairovirus、Nayun tick torquevirus等多種新病毒[9]，但對其媒介蜱的相關調查較少[10]。為了彌補此不足，本文在云南省西部橫斷山區進行蜱蟲調查。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2014年5月在云南省大理州的家養動物體表采集蜱，魏山縣采集473只、彌渡縣85只，6月在云南省保山隆陽區的家養動物體表采集蜱1 316只，置液氮保存。

1.2 形態學鑒定 依據參考文獻[11]分類檢索表中的描述，在體視顯微鏡(SMZ-45T3，重光儀器有限公司)下進行形態學觀察鑒定。

1.3 PCR檢測 以生理鹽水作為研磨液將經形態學鑒定的蜱種分別進行研磨，每份樣品取60 μL研磨懸液，采用Qiagen公司的組織DNA提取試劑盒，按說明書操作提取總DNA。應用文獻[12-15]中的引物及條件對樣品的16S rRNA、12S rRNA、細胞色素C氧化酶亞基I基因(cytochrome oxidase subunit I，CO I)和核糖體DNA內轉錄間隔2(the internal transcribed spacers 2 of ribosomal DNA， ITS2)基因分別進行PCR擴增，目的基因片斷大小分別為約460 bp、380 bp、660 bp、920～1 850 bp，引物由武漢擎科生物科技有限公司合成。PCR反應總體積為50 μL, 應用北京全式金生物技術有限公司2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒在Biometra TProfessional PCR儀中進行PCR擴增，以無菌水作為陰性對照，無陽性對照。PCR擴增時取2 μL被檢樣本DNA為模板，6 μL PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測，DL2000 DNA Marker 來自于大連寶生物公司。

1.4 DNA序列測定及分析 PCR陽性產物送武漢擎科生物科技有限公司進行序列測定。利用SeqMan軟件拼接序列后，通過Internet網進入美國國家生物技術信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)利用“BLAST”工具和采用DNAstar中的MegAlign軟件對序列進行同源性比較，并運用MEGA6.06軟件Neighbor-joining法自展1000次構建系統發育樹。

2 結 果

2.1 形態學鑒定 共計1 874只成蟲蜱，經形態學鑒定為1科(硬蜱科Ixodidae)、1屬(扇頭蜱屬Rhipicephalus)、4種(見圖1)，其中微小扇頭蜱(R.microplus)1 637只(占87.35%)，鐮形扇頭蜱(R.haemaphysaloides)218只(11.63%)，短小扇頭蜱(R.pumilio)11只(0.59%)，血紅扇頭蜱(R.sanguineus)8只(占0.43%)。寄生于家畜水牛、黃牛、山羊、家犬體表最多的蜱種分別為微小扇頭蜱(811只，占43.27%)、微小扇頭蜱(712只，占37.99%)、鐮形扇頭蜱(160只，占8.54%)、鐮形扇頭蜱(26只，占1.38%)(見表1)。

注：A：微小扇頭蜱(雄)；B：鐮形扇頭蜱(雄)；C：血紅扇頭蜱(雌)；D：短小扇頭蜱(雌)A：R. microplus(male)；B：R. haemaphysaloides (male)；C：R. sanguineus (female)；D：R. pumilio (female)圖1 四種扇頭蜱Fig.1 Four species of Rhipicephalus

表1 滇西部分地區蜱類及其宿主動物的組成
Tab.1 Ticks and hosts in the west of Yunnan Province

微小扇頭蜱(%)R.microplus鐮形扇頭蜱(%)R.haemaphysaloides短小扇頭蜱(%)R.pumilio血紅扇頭蜱(%)R.sanguineus合計(%)Total水Buffalo811(43.27)18(0.96)11(0.59)0(0.00)840(44.82)黃牛Cattle712(37.99)14(0.75)0(0.00)0(0.00)726(38.74)山羊Goat100(5.34)160(8.54)0(0.00)0(0.00)260(13.88)家犬Dog14(0.75)26(1.38)0(0.00)8(0.43) 48(2.56)合計Total1637(87.35)218(11.63)11(0.59)8(0.43)1874(100)

2.2 PCR擴增蜱基因及序列分析 對經形態學鑒定的微小扇頭蜱Y2、鐮形扇頭蜱Y5、短小扇頭蜱Y6和Y01、血紅扇頭蜱Y11分別進行16S rRNA、12S rRNA、COI、ITS2基因片斷擴增，結果樣本Y2的4個基因片斷均獲得序列，Y5獲得16S rRNA、12S rRNA、COI 3個基因序列，Y6和Y01獲得ITS2基因序列，Y11的4個基因均測序失敗。應用MegAlign軟件將所獲得的樣本序列與GenBank中已知參考序列進行核苷酸相似性比較分析。

樣本微小扇頭蜱Y2的基因序列分析顯示：16S rRNA基因序列與印度微小扇頭蜱(EU918188)的相似性為99.8%，與中國云南微小扇頭蜱(JX051062)的相似性為99.4%； 12S rRNA基因序列與中國貴州微小扇頭蜱(KC503259)的相似性最高，為98.2%； COI基因序列與馬來西亞微小扇頭蜱(KM246873)的相似性為99.8%, 與中國云南微小扇頭蜱(KF583579)的相似性93.8%；ITS2基因序列與中國貴州微小扇頭蜱(KC503274)的相似性為100%, 與中國云南微小扇頭蜱(KC203364)的相似性99.9%。

樣本鐮形扇頭蜱Y5序列分析顯示：16S rRNA基因序列與泰國鐮形扇頭蜱(KC170743)的相似性為99.4%，與中國臺灣鐮形扇頭蜱(AY883868)的相似性為94.4%；12S rRNA基因序列與中國臺灣鐮形扇頭蜱(DQ003005)的相似性最高，為95.4%；COI基因序列與中國湖南鐮形扇頭蜱(KM083593)的相似性最高，為99.8%。

樣本短小扇頭蜱Y6和Y01基因序列分析顯示：兩ITS2基因序列均與澳大利亞短小扇頭蜱(AF271282)的相似性最高，分別為91.9%和92.0%。

2.3 系統發育樹分析 根據蜱蟲16S rRNA基因部分核苷酸序列進行系統發育樹分析，結果顯示Y2與印度微小扇頭蜱(EU918188)在同一分支上，與中國云南微小扇頭蜱(JX051062)不在同一分支上，表明Y2與印度微小扇頭蜱的親緣關系較近，而與云南微小扇頭蜱的親緣關系稍遠；Y5與泰國鐮形扇頭蜱(KC170743)在同一分支上，與中國臺灣鐮形扇頭蜱(AY883868)不在同一分支上，表明Y5與泰國鐮形扇頭蜱的親緣關系較近(見圖2)。

根據蜱蟲12s rRNA基因部分核苷酸序列進行系統發育樹分析，結果顯示Y2與中國貴州微小扇頭蜱(KC503259)在同一分支上，Y5與中國臺灣鐮形扇頭蜱(DQ003005)在同一分支上，表明Y2與貴州微小扇頭蜱的親緣關系較近，Y5與臺灣鐮形扇頭蜱的親緣關系較近(見圖3)。

根據蜱蟲COI基因部分核苷酸序列進行系統發育樹分析，結果顯示Y2與馬來西亞微小扇頭蜱(KM246873)在同一分支上, 與中國云南微小扇頭蜱(KF583579)不在同一分支上，表明Y2與馬來西亞微小扇頭蜱的親緣關系較近，而與云南微小扇頭蜱的親緣關系遠；Y5與中國湖南鐮形扇頭蜱(KM083593)在同一分支上，表明Y5與湖南鐮形扇頭蜱的親緣關系較近(見圖4)。

根據蜱蟲ITS2基因部分核苷酸序列進行系統發育樹分析，結果顯示Y2與中國貴州微小扇頭蜱(KC503274)在同一分支上, 與中國云南微小扇頭蜱(KC203364)不在同一分支上，表明Y2與貴州微小扇頭蜱的親緣關系較近，而云南微小扇頭蜱的親緣關系遠；Y6和Y01與澳大利亞短小扇頭蜱(AF271282)在同一分支上，表明Y6和Y01與澳大利亞短小扇頭蜱的親緣關系較近(見圖5)。

3 討 論

云南以往已證實存在多種蜱傳疾病疫源地，并已發現嗜吞噬細胞無形體、新布尼亞病毒、科羅拉多病毒等多種蜱傳病原體的存在[8,16]。云南西部橫斷山區為國家級重要自然保護區，該地區山多、植被茂盛，地理環境復雜，與蜱傳疾病相關的宿主動物和媒介節肢動物種類繁多，是恙蟲病、斑疹傷寒、斑點熱等多種自然疫源性疾病的主要疫源地[17-18]，然而該地區媒介蜱的相關調查工作較少。本次調查在水牛、黃牛、山羊和家犬四種家畜體表共捕獲蜱蟲1 874只，經形態學和分子鑒定為1科、1屬(扇頭蜱屬)、4種，其中微小扇頭蜱為該地區家畜體表蜱蟲優勢種。 微小扇頭蜱的宿主動物有水牛、黃牛、山羊和家犬，其中寄生于牛的最多(占81.27%)。鐮形扇頭蜱的宿主動物有水牛、黃牛、山羊和家犬，短小扇頭蜱和血紅扇頭蜱的宿主動物分別為水牛、家犬。

圖2 根據蜱16S rRNA基因部分序列構建系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of partial segments of tick 16S rRNA gene

圖3 根據蜱12S rRNA基因部分序列構建系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of partial segments of tick 12S rRNA gene

圖4 根據蜱COI基因部分序列構建系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of partial segments of tick COI gene

圖5 根據蜱ITS2基因部分序列構建系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of partial segments of tick ITS2I gene

蜱基因核苷酸序列發育樹分析顯示，微小牛蜱Y2的16S rRNA、12S rRNA、COI和ITS2基因序列分別與來自印度、中國貴州、馬來西亞和貴州的微小扇頭蜱在同一分支上，而與以往云南發現的微小扇頭蜱不在同一分支，提示本次發現的微小扇頭蜱Y2與印度、馬來西亞和貴州微小扇頭蜱的遺傳進化關系較為密切，而與以往云南發現的微小扇頭蜱的遺傳進化關系稍遠；鐮形扇頭蜱Y5的16S rRNA、12S rRNA和COI基因序列分別與來自泰國、臺灣和湖南的鐮形扇頭蜱在同一分支上，提示本次發現的鐮形扇頭蜱Y5與泰國、臺灣、湖南鐮形扇頭蜱的遺傳進化關系較為密切；短小扇頭蜱Y6和Y01的ITS2基因序列與來自澳大利亞的短小扇頭蜱在同一分支上，表明本次檢測的短小扇頭蜱與澳大利亞短小扇頭蜱遺傳進化關系較近，但序列同源性僅在91.9%～92%。通過基因序列分析顯示云南蜱種與國內外臨近地區蜱種之間的親緣關系較近，但它們之間存在一定的差異，具有區域差異性。

以往資料證實云南具有蜱類46種居我國首位，但沒有短小扇頭蜱的記錄[11,19]。本次經形態學和分子生物學綜合鑒定證實云南存在短小扇頭蜱，該蜱為斑點熱群中的勞氏立克次體的宿主[7]，斑點熱病例在云南早已發現[18]，短小扇頭蜱在斑點熱等蜱傳疾病的發生和傳播中所起作用值得進一步研究。

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Tick species and genetic variants analysis of tick gene in Hengduan Mountains, west Yunnan Province, China

YA Hong-xiang1, SHEN Shu2, SU Zheng-yuan2, DENG Fei2, ZHANG Yun-zhi1

(1.YunnanInstituteofEndemicDiseasesControlandPrevention/YunnanProvincialKeyLaboratoryofNaturalFocalDiseaseControlandPrevention,Dali671000,China;2.WuhanInstituteofVirology,ChinaAcademyofScience,Wuhan430071,China)

To investigate the species composition and genetic variants of ticks in Hengduan Mountains of the western Yunnan Province, 1 874 individual ticks were captured from the body surface of domestic animals and were identified as four species of one genus of one family by species morpholog. Of them, 97.35% (1 637/1 874) of ticks wereRhipicephalusmicroplus, 11.63% (218/1 874)Rhipicephalushaemaphysaloides, 0.59% (11/1 874)Rhipicephaluspumilioand 0.43% (8/1 874)Rhipicephalussanguineus. The 16S rRNA, 12S rRN, COI and ITS2 segments of ticks were amplified separately by PCR and sequenced. Phylogenetic analysis showed thatR.microplusY2 (sample number) was in the same branch withR.microplusfrom Inida (EU918188), Guizhou of China (KC503259), Malaysia (KM246873) and Guizhou of China (KC503274) through 16S rRNA, 12S rRNA, COI and ITS2 sequences analysis respectively, but was differentR.microplusfomerly reported from Yunnan of China.R.haemaphysaloidesY5 was in the same branch withR.haemaphysaloidesfrom Thailand (KC170743), Taiwan (DQ003005) and Hunan of China (KM083593) through 16s rRNA, 12S rRNA and COI sequences analysis respectively.R.pumilioY6 and Y01 were in the same branch withR.pumiliofrom Australian (AF271282). It was concluded thatR.microplusis the dominant tick species of domestic animals in Hengduan Mountains,the west of Yunnan Province. In addition,

tick; PCR detection; gene sequence analysis; Yunnan Province

Zhang Yun-zhi, Email: zhanyunzhi1818@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.003

國家自然科學基金(No.81260437, No.81060132)；傳染病預防控制國家重點實驗室基金(No.2013SKLID302);科技基礎性工作專項重點項目(No.2013FY113500)

張云智，Email: zhanyunzhi1818@163.com

1.云南省地方病防治所/云南省自然疫源性疾病防控技術重點實驗室, 大理 671000；

2.中國科學院武漢病毒研究所，武漢 430071

R384.4

A

1002-2694(2016)10-0865-06

2016-05-11；

2016-07-05

R.pumiliomay be a new record in Yunnan.

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81260437 & 81060132), the Project of State Key Laboratory for Infectious Diseases Prevention and Control (No. 2013SKLID302) and the Scientific and Technological Basis Special Project from the Minister of Science and Technology of the People’s Republic of China (No. 2013FY113500)