福建省耐多藥結核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物表型耐藥與gyrA基因突變特征分析

魏淑貞，趙 永，梁慶福，林 建，林淑芳

?

福建省耐多藥結核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物表型耐藥與gyrA基因突變特征分析

魏淑貞1，趙 永1，梁慶福1，林 建1，林淑芳1

目的 了解福建省耐多藥(Multi-drug resistant, MDR)結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，FQs)的gyrA基因突變特征，為FQs耐藥菌株的快速分子藥敏檢測提供基礎科學數據。方法 收集來自福建省2010-2011年和2008-2009年耐藥監測點的所有MDR Mtb臨床菌株，采用常規比例法進行FQs敏感性試驗。PCR擴增包含gyrA耐藥決定區的基因片段，測序后比對分析。結果 共收集到MDR結核分枝桿菌臨床菌株119株，經常規藥敏試驗，氧氟沙星(Ofloxacin,Ofx)的耐藥率為26.89%,左氧氟沙星(Levofloxacin,Lfx)耐藥率為25.21%，莫西沙星(Moxifloxacin,Mfx)耐藥率為11.76%。FQs敏感株gyrA基因未檢測到突變。gyrA基因在Ofx耐藥菌株的突變率為84.38%(27/32)，Lfx耐藥菌株的突變率為83.33%(25/30), Mfx耐藥菌株的突變率為92.86%(13/14)。gyrA基因突變為點突變，共發現有5種突變類型，以Asp94Gly，Asp94Asn和Ala90Val為主。結論 福建省MDR-Mtb對FQs耐藥的主要原因是gyrA基因突變，最常見的突變位于第94位，第90位和第91位密碼子。

結核分枝桿菌；耐多藥；氟喹諾酮類藥物；基因突變

結核病(tuberculosis, TB)是嚴重威脅全球公共衛生的傳染性疾病。耐藥結核病，尤其是耐多藥(multidrug resistant TB，MDR-TB)和廣泛耐藥(extensively drug resistant TB， XDR-TB)的出現及傳播增加了結核病控制和治療的難度。氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，FQs)是目前用于治療耐藥和MDR-TB及XDR-TB的核心二線抗結核藥物，包括氧氟沙星(Ofloxacin，Ofx)，左氧氟沙星(Levofloxacin，Lfx)，莫西沙星(Moxifloxacin，Mfx)等藥物，同時該類藥物也用于對一線抗結核藥物不能耐受者的治療。然而，FQs被廣泛用于呼吸道、胃腸道及泌尿系統感染等的治療，以及FQs的不規范使用導致結核病對FQs的耐藥水平增加。據2007-2008年全國結核病耐藥性基線調查報告顯示：MDR-TB患者中Ofx的耐藥率為27.43%[1]。對MDR-TB進行FQs耐藥的研究受到關注。

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)DNA旋轉酶是FQs作用于Mtb的唯一靶標，FQs通過抑制DNA旋轉酶的活性，阻止該酶拓撲異構變化，干擾細菌復制、修復和重組，導致細菌死亡。Mtb旋轉酶由2個A和2個B亞單位組成，分別由gyrA和gyrB兩個基因編碼。對于臨床Mtb菌株，gyrB基因較少發生突變，gyrA基因突變是Mtb對FQs耐藥的最主要原因,并且突變位點主要集中于gyrA基因的FQs耐藥決定區(QRDR)[2]。然而，gyrA基因突變的頻率和突變類型具有地區差異。為了掌握福建省MDR-Mtb對FQs的表型耐藥及耐藥基因gyrA的突變特征，我們對來自福建省耐藥監測點的119株MDR-Mtb臨床分離株進行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株 119株MDR-Mtb臨床菌株中，79株分離自2010-2011年福建省30個耐藥監測點，另40株分離自2008-2009年福建省9個耐藥監測點。標準菌株H37Rv由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供。

1.2 菌種鑒定和藥物敏感性試驗 收集來的菌株經改良羅氏(L-J)培養基培養2～3周，用含對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養基及對照培養基鑒別結核分枝桿菌、牛結核桿菌和非結核分枝桿菌。采用WHO推薦的比例法[3]進行敏感性試驗，各藥物臨界濃度分別為：INH 0.2 μg/mL, RFP 40 μg/mL, SM 4 μg/mL, EMB 2 μg/mL，Ofx 2 μg/mL, Lfx 2 μg/mL和Mfx 0.25 μg/mL。

1.3 制備DNA 從L-J培基中生長良好的Mtb取一菌環，溶于200 μL TE(pH=8.0)中，經旋渦振蕩器上振蕩均勻后，放在95℃水浴鍋中15 min后，3 000 r/min離心5 min，取上清。

1.4 基因擴增及檢測 采用上游引物：5′-GGGTGCTCTATGCAATGTTCG-3′，下游引物為5′-GCCGTCGTAGTTAGGGATGA-3′，擴增含gyrA基因耐藥決定區(第74-103個密碼子)的DNA片段長度為314 bp。PCR反應體系為50 μL， 包括2ⅹTaq PCR Master Mix 25 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL，模板5 μL，去離子水18 μL。PCR 擴增條件:94 ℃變性8 min ;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s,30個循環;再72 ℃延伸5 min。同時用H37Rv的DNA作為陽性對照，用去離子水作為陰性對照。PCR產物送北京擎科生物技術有限公司進行測序。

1.5 測序結果比對分析 測序序列以純文本形式查詢序列輸http://www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST查詢框，與標準菌株H37Rv 的gyrA基因序列進行比對。同時排除測序引起的誤差判斷測序結果。

1.6 數據處理與分析 菌株背景及測序結果用統計軟件SPSS 13.0分析相關數據，經χ2檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 FQs耐藥情況 經傳統藥敏檢測，119株有32株對Ofx耐藥， Ofx耐藥率為26.89%，30株耐Lfx，Lfx耐藥率為25.21%，14株耐Mfx(11.76%)，13株耐KM(10.9%),如表1所示。標準菌株H37Rv的藥敏結果均為敏感。

表1 119株MDR結核分枝桿菌臨床菌株FQs的耐藥情況
Tab.1 Susceptibility of FQs about119 MDR-Mtb strains

ResistanttoNo.ofstrainsResistantrate(%)AnyofFQs Ofx3226.89 Lfx3025.21 Mfx1411.76 KM1310.9CrossresistanttoFQs Ofx+Lfx+Mfx1411.76 Ofx+Lfx1613.44 Ofx21.68

2.2 MDR-Mtb基因突變情況 119株MDR-Mtb測序結果經BLAST比對，118株菌株均發現gyrA基因第95位AGC→ACC突變。32株Ofx耐藥菌株中有27株gyrA基因第90位，第91位和第94位密碼子的突變，突變率為84.38%(27/32)。87株Ofx敏感株未發現其他位點突變。質控菌株H37Rv的gyrA基因無發生突變。

2.3 MDR-Mtb菌株gyrA基因耐藥決定區突變特征 32株Ofx 耐藥菌株有27株gyrA基因發生突變，突變率84.38%(27/32)，14株第94位密碼子發生突變，其中6株發生94Asp→Gly突變，5株發生94Asp→Asn突變，3株發生94Asp→Ala突變；有9株第90位發生GCG→GTG(Ala→Val)突變；4株第91位發生TCG→CCG(Ser→Pro)突變。30株Lfx耐藥菌株有13株第94位突變，其中6株發生94Asp→Gly突變，5株發生94Asp→Asn突變，2株發生94Asp→Ala突變；有8株90Ala→Val突變；有4株91Ser→Pro突變。14株Mfx耐藥菌株有11株第94位發生突變，其中5株94Asp→Asn突變，5株94Asp→Gly突變，1株94Asp→Ala突變； 90Ala→Val突變和91Ser→Pro突變各1株。詳見表2。

表2 MDR結核分枝桿菌FQs耐藥相關的gyrA基因突變特征
Tab.2 Characteristics of gyrA mutation associated with resistant to FQs in MDR-Mtb strains

OfxLfxMfxSpecificmutationAcidaminochangeNo.ofstrainsMutationrate(%)RRR90GCG→GTG90Ala→Val13.70RRR91TCG→CCG91Ser→Pro13.70RRR94GAC→AAC94Asp→Asn518.52RRR94GAC→GCC94Asp→Ala13.70RRR94GAC→GGC94Asp→Gly518.52RRS90GCG→GTG90Ala→Val725.93RRS91TCG→CCG91Ser→Pro311.11RRS94GAC→GCC94Asp→Ala13.70RRS94GAC→GGC94Asp→Gly13.70RSS90GCG→GTG90Ala→Val13.70RSS94GAC→GCC94Asp→Ala13.70

3 討 論

FQs與其他抗結核藥物聯合應用于治療結核病，特別是耐藥結核病具有良好的治療效果。同時該類藥物被臨床廣泛用于各類感染治療，加上濫用現象，對FQs耐藥問題越來越嚴重。本研究中119株MDR-Mtb有32株對FQs耐藥，耐藥率為26.89%，略低于全國耐藥基線調查報告的27.43%[1]，遠低于國內學者報道的40%[4]，這可能與菌株來源有關，同時也說明了MDR-Mtb對FQs耐藥具有一定的地區差異。本研究Mfx耐藥的菌株對Ofx和Lfx 均產生耐藥；30株Lfx耐藥的菌株全部對Ofx耐藥，有16株對Mfx敏感(53.33%)，進一步說明Ofx，Lfx和Mfx之間為不完全交叉耐藥，對于Ofx耐藥患者，WHO 推薦Lfx或Mfx用于Ofx耐藥患者的治療[5]。本研究119株MDR菌株有41株為pre-XDR(占34.45%)，感染pre-XDR的患者發展成為XDR-TB的危險性極高，所以盡早發現pre-XDR患者并進行有效治療格外關鍵。有效治療MDR-TB患者最好進行藥敏試驗，而傳統藥敏試驗耗時長，所需環境條件高，因此建立準確檢測FQs等二線抗結核藥物耐藥的快速分子藥敏勢在必行。

gyrA基因是DNA旋轉酶A亞基的編碼基因，該基因突變導致FQs無法與DNA旋轉酶A亞基結合，使MTB對FQs產生耐藥[2]。32株FQs耐藥的MDR菌株在gyrA基因均有第95位AGC→ACC 突變，同時有27株FQs耐藥株發生其他位點的突變，86株FQs敏感的菌株在gyrA基因均檢測出第95位發生AGC→ACC 突變而其他位點未發生突變，另一株FQs敏感的菌株未發現任何位點的突變，這說明gyrA基因AGC95ACC是遺傳多態性的一種表現[4-8]，與FQs耐藥性無關。本研究中Ofx 耐藥菌株gyrA基因的突變率為84.38%(27/32)，與俄羅斯報道的83%相仿[9]，與國內報道的78%接近[5]。Lfx耐藥菌株的突變率為83.33%(25/30), Mfx耐藥菌株的突變率為92.86%。Mfx耐藥株的突變率稍高于Ofx 耐藥株和Lfx耐藥株的突變率，可能與Mfx耐藥的菌株同時也對Ofx和Lfx耐藥有關，而這些FQs耐藥的共同機制主要是gyrA基因突變[10]。

本實驗32株FQs耐藥菌株有27株在gyrA基因發現有義突變，主要突變位于第94位密碼子，其次為第90位，再次是第91位。Ofx 耐藥株和Lfx耐藥株的gyrA基因突變均以Ala90Val最為常見，其次為Asp94Gly和Asp94Asn。Mfx耐藥株突變以Asp94Gly和 Asp94Asn為常見。有文獻報道gyrA基因第74,83,87,88,89位等[11-12]位點的突變以及同一株菌gyrA基因存在雙位點突變[13-14]，而在本研究尚未發現。本次實驗有5株FQs耐藥菌株(占15.63%)未發現gyrA基因突變，提示了這些菌株可能存在FQs耐藥的其他機制，比如gyrB基因突變，藥物主動外排泵的過度表達以及細胞膜的通透性下降等[15]，有待進一步深入研究。在福建省臨床FQs耐藥的MTB分離株中，未發現gyrB基因突變[16]，這充分提示了gyrA基因突變是福建省FQs耐藥的MDR-TB臨床分離株的主要耐藥機制，主要突變位于第94位、第90位、第91位密碼子。gyrA基因可以作為福建省FQs耐藥的理想分子標記物，通過檢測這些位點的突變情況來快速預測FQs是否耐藥，從而為臨床患者的診療贏得時間，減少耐藥的傳播。

有文獻報道[7]gyrA基因Asp94Asn和Asp94Gly可能引起FQs較高水平耐藥； Ala90Val和Asp94Ala可能引起FQs低水平耐藥。另有報道[8]gyrA基因Asp94Asn只發生在FQs低耐藥株，Ala90Val和Asp94Gly在FQs高水平耐藥株當中占多數。本研究MDR菌株的突變類型以Asp94Gly，Asp94Asn 和 Ala90Val為主，是否意味著福建省MDR-Mtb菌株以FQs高水平耐藥為主，而本次研究僅單純按照WHO推薦的濃度進行FQs藥敏測定，尚未對Ofx耐藥的菌株進行最低抑菌濃度(MIC)的檢測，因此gyrA基因突變位點與突變類型是否與FQs的耐藥水平有關，有待進一步驗證研究。

[1] Zhao YL, Xu SF, Wang LX, et al. National survey of drug-resistant tuberculosis in China[J]. N Engl J Med, 2012, 366: 2161-2170.

[2] Alangaden GJ, Manavathu EK, Vakulenko SB, et al. Characterization of fluoroquinolone resistant mutant strains ofMycobacteriumtuberculosisselected in the laboratory and isolated from patients[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39(8): 1711-1713.

[3] Canetti G, Froman S, Grosset J, et al. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance[J]. Bull World Health Organ, 1963, 29: 565-578.

[4] WHO. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis[M]. WHO/HTM/TB/2008. 402. Geneva: WHO, 2008.

[5] Zhao LL, Xia Q, Zhao XQ, et al. Quinolone resistance andgyrgene mutations in multi-drug resistant ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(5): 390-393. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2011.05.03 (in Chinese)

趙麗麗，夏強，趙秀芹，等.耐多藥結核分枝桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性與gyr基因突變的初步研究[J].中國人獸共患病學報，2011,27(5):390-393.

[6] Chakravorty S, Aladegbami B, Thoms K, et al. Rapid detection of fluoroquinolone-resistant and heteroresistantMycobacteriumtuberculosisby use of sloppy molecular beacons and dual melting-temperature codes in a real-time PCR assay[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(3): 932-940. DOI:10.1128/JCM.02271-10

[7] Li GL, Chen P, Sun CW, et al. The cross-resistance to levofloxacin and moxifloxacin inMycobacteriumtuberculosisand gene mutations ingyrAandgyrB[J]. Chin J Antituberculosis, 2010, 32(10): 616-621. (in Chinese)

李國利，陳澎，孫昌文，等. 結核分枝桿菌對左氧氟沙星與莫西沙星的交叉耐藥性及gyrA和gyrB基因突變分析[J].中國防癆雜志，2010,32(10)：616-621.

[8] Zhao WJ, Li P, Lu Y. Study on the cross-resistance of moxifloxacin and levofloxacin inMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Antituberculosis, 2009, 31(8): 469-472. (in Chinese)

趙偉杰，李芃，陸宇. 莫西沙星與左氧氟沙星對結核分枝桿菌的交叉耐藥性研究[J].中國防癆雜志，2009，31(8)：469-472.

[9] Mokrousov I, Otten T, Manicheva O, et al. Molecular characterization of ofloxacin-resistantMycobacteriumtuberculosisstrains from Russia[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(8): 2937-2939. DOI:10.1128/AAC.00036-08

[10] Avalos E, Catanzaro D, Catanzaro A, et al. Frequency and geographic distribution ofgyrAandgyrBmutations associated with fluoroquinolone resistance in clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates: A systematic review[J]. PLoS ONE, 10(3): e0120470. DOI: 10.1371/journal.pone.0120470

[11] Huang WL, Lin T, Wu MH, et al. Performance assessment of the GenoType MTBDRsl/test and DNA sequencing for detection of second-line and ethambutol drug resistance among patients infected with multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(7): 2502-2508. DOI: 10.1128/JCM.00197-11

[12] Hu Y, Hoffner S, Wu LL, et al. Prevalence and genetic characterization of second-line drug-resistant and extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisin rural China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 57(8): 3857-3863. DOI: 10.1128/AAC.00102-13[13] Aubry A, Sougakoff W, Bodzongo P, et al. First evaluation of drug-resistantMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from Congo Revealed Misdetection of fluoroquinolone resistance by line probe assay due to a double substitution T80A-A90G in GyrA[J]. PLoS ONE, 9(4): e95083. DOI: 10.1371/journal.pone.0095083

[14] Zhao LL, Chen Y, Liu HC, et al. Molecular characterization of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 58(4): 31997-2005. DOI: 10.1128/AAC.01792-13

[15] Chen J, Chen Z, Li Y, et al. Characteristization ofgyrAandgyrBmutations and fluoquinolone resistance inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from Hubei Province, China[J]. Braz J Infect Dis, 2012, 16(2): 136-141.

[16] Chen QY, Pang Y, Liang QF, et al. Molecular characteristics of MDRMycobacteriumtuberculosisstrain isolated in Fujian, China[J]. Tuberculosis, 2014, 94: 159-161.

Phenotypic fluoroquinolones resistance and characteristics ofgyrAmutation in MDRMycobacteriumtuberculosisisolates in Fujian, China

WEI Shu-zhen, ZHAO Yong, LIANG Qing-fu, LIN Jin, LIN Shu-fang

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention/FujianPriorityLaboratoryforZoonoses,Fuzhou350001,China)

Our study investigated the phenotypic fluonoquinolones resistance and the molecular characteristics of mutation ingyrAin MDRMycobacteriumtuberculosis(Mtb) clinical strains in Fujian Province, and provided some reference for rapid molecular detection of fluonoquinolones resistance inMtb. MDR isolates collected from drug resistant survey sites through the province in 2010-2011 and 2007-2008, and the strains were conducted FQs susceptibility testing by proportion method. The quinolone resistant determining region (QRDR) ingyrAwas amplified by PCR and the PCR products were sequenced, the results of sequencing were blasted with H37Rv. Of 119 strains were collected and performed FQs susceptibility testing. The rate of resistant to FQs was 26.89% (Ofloxacin, Ofx), 25.21% (Levofloxacin, Lfx), and 11.76% (Moxifloxacin, Mfx) respectively. No mutation was found ingyrAin fluonoquinolones sensitive MDR strains. The mutation rate ofgyrAin Ofx resistant MDR strains was 84.38% (27/32), the mutation rate of Lfx resistant MDR was 83.33% (25/30), and that of Mfx was 92.86% (13/14). The characteristic ofgyrAmutation in our study was point mutation, with five mutation types, and mainly was Asp94Gly, Asp94Asn and Ala90Val. Thus, we conclude thatgyrAmutation is the main reason of MDR strains resistant to flunoquinolones in Fujian Province. And the most common mutation is in the codon 94, codon 90, and codon 91.

Mycobacteriumtuberculosis; multi-drug resistant; fluoroquinolones; gene mutation

Lin Shu-fang, Email: zqszl@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.005

林淑芳，Email: zqszl@163.com

福建省疾病預防控制中心，福建省人獸共患病重點研究實驗室，福州 350001

R378.91

A

1002-2694(2016)10-0876-04

2016-04-27；

2016-08-24

福建省自然科學基金課題(No.2014J01280)資助

Supported by the Fujian Provincial Science Foundation Project (No. 2014J01280)