陳達++++++廖州偉++++++馬篤軍++++++王立新++++++彭力平

[摘要] 目的 比較牛膝醇提物（AEAB）與硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因對于兔骨關節炎（OA）的療效。 方法 將35只實驗兔采用隨機區組分組法分為正常組、模型組、AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組，每組7只。石膏固定制動6周制備OA模型，造模后，分別以蒸餾水、AEAB、硫酸氨基葡萄糖及雙醋瑞因灌胃，正常組不予處理，6周后處死實驗兔，取軟骨標本進行大體觀察、Pelletier評分、Mankin評分，用免疫組化測定軟骨Ⅱ型膠原蛋白含量，用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清和關節液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）以及基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）的含量。 結果 AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組Pelletier評分、Mankin評分、Ⅱ型膠原蛋白含量、血清和關節液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量分別與正常組、模型組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；AEAB組與硫酸氨基葡萄糖組及雙醋瑞因組比較，上述指標差異均無統計學意義（均P > 0.05）。 結論 AEAB可以促進兔OA模型的軟骨修復，其療效與硫酸氨基葡萄糖及雙醋瑞因相當，具有較高的臨床應用價值。

[關鍵詞] 牛膝醇提物；骨關節炎；硫酸氨基葡萄糖；雙醋瑞因；療效

[中圖分類號] R684.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）09（a）-0021-04

[Abstract] Objective To compare the effects of alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix （AEAB）， glucosamine sulfate and Diacerein in the treatment of rabbits with osteoarthritis （OA）. Methods With blocked randomization， thirty-five experimental rabbits were divided into normal group， model group， AEAB group， glucosamine sulfate group， Diacerein group， with 7 rabbits in each group. The OA models were established by immobilizing rabbits， knees with plaster cast for 6 weeks， and distilled water， AEAB， glucosamine sulfate， Diacerein were respectively given by lavage after modeling. Normal group was not treated. The experimental rabbits were killed six weeks later， and the cartilage samples were taken to perform gross observation， Pelletier score， Mankin score， and the type Ⅱ collagen was measured by immunohistochemistry method and the tumor necrosis factor alpha （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and matrix metallo-proteinase-3 （MMP-3） in serum and joint fluid were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method. Results There were all statistically significant differences of Pelletier score， Mankin score， content of type Ⅱ collagen， TNF-α， IL-1β and MMP-3 in AEAB group， glucosamine sulfate group， Diacerein group compared with normal group and model group respectively （P < 0.05 or P < 0.01）， while there were no statistically significant differences in aforementioned indexes among AEAB group， glucosamine sulfate group and Diacerein group respectively （all P > 0.05）. Conclusion AEAB can promote the cartilage repair in rabbits with OA， and it has equivalent effects with glucosamine sulfate and Diacerein， so it has high value in clinical application.

[Key words] Alcohol extract of Achyranthis Bidentatae Radix； Osteoarthritis； Glucosamine sulfate； Diacerein； Effects

骨關節炎（OA）是以關節軟骨退行性變為核心病理改變的慢性關節疾病，硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因作為治療OA的西藥代表，可以預防OA的進一步發展和促進軟骨修復[1-2]。目前有研究證實[3]，部分中藥也有促進軟骨修復的作用。本課題組前期實驗表明，牛膝醇提物（AEAB）能增加兔關節軟骨細胞增殖[4-5]。本研究進一步探討了AEAB促進軟骨修復的機制，并比較了其與硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因對OA的療效，希望為臨床應用AEAB治療OA提供依據和指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康新西蘭兔35只，兔齡2～3個月，體重（1.86±0.52）kg，雌雄不限，由廣東省實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（粵）2014-0035；動物飼料許可證號：SCXK（粵）2013-0002。本研究遵循了單位、地區以及國家所制訂的有關實驗動物保護和使用的指南，并經實驗動物倫理委員會批準。

1.2 實驗藥物及試劑

硫酸氨基葡萄糖（信東生技股份有限公司提供，批號：7KB0102，國藥產品注冊證號：HC20120036）；雙醋瑞因（昆明積大制藥股份有限公司提供，批號：國藥準字J201000150，進口藥品注冊證號：H20100350）；AEAB（深圳市中醫院提供，批號：20150731）；Rabbit腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）Kit（貨號：AE90301Rb）、Rabbit白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA Kit、（貨號：AE90731Rb）、Rabbit基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）ELISA Kit（貨號：3460）由AMEKO公司提供；免疫組化第一抗體Anti-Collagen Type Ⅱ由德國默克密理博公司提供（貨號：CP18-100UGCN）。

1.3 AEAB的制備

依據《中國藥典》[6]浸漬法制備：每毫升醇提液相當于含原材料1 g。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 健康新西蘭兔35只，適應性喂養1周后采用隨機區組分組法進行分組，分為正常組、AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組、雙醋瑞因組及模型組，每組各7只，一兔一籠進行標準喂養，每天觀察實驗兔的食量、大小便、活動度、步態及精神狀況。

1.4.2 造模方法 參考曾俊華等[7]的實驗研究進行造模：將兔右膝關節用棉墊包裹好后于伸直位管型石膏固定制動6周，每天記錄實驗兔肢端血液循環及石膏穩定度情況，若發現石膏松動脫落，立即重新打制石膏固定，若發現石膏過緊，肢端血液循環差、掉毛、皮膚壞死及潰瘍等情況，立即用石膏剪調整石膏松緊度。

1.4.3 藥物干預 參照藥理試驗中動物與人體間的等效劑量進行換算：結合體重按相應劑量用蒸餾水稀釋成10 mL后連續灌服6周：牛膝組：1 mg/（kg·d）；硫酸氨基葡萄糖組：77 mg/（kg·d）；雙醋瑞因：5.1 mg/（kg·d），每天灌胃2次，模型組：蒸餾水10 mL，每天灌胃2次；正常組不予處理。

1.4.4 ELISA法檢測血清和關節液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量 自兔耳緣靜脈取血10 mL，取血清。將兔麻醉，造模膝關節剪毛、消毒，用l mL生理鹽水沖洗關節腔，抽出沖洗液，3000 r/min離心10 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。待所有標本均采集完畢后，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.4.5 關節軟骨常規病理學檢測 灌胃6周后將全部實驗兔以空氣栓塞法處死，將右膝關節上下1.0～1.5 cm處用銳器切斷，整塊取下股骨髁部和脛骨平臺，首先按Pelletier原則[8]進行關節軟骨大體形態學觀察評分，分值越高說明軟骨退變越嚴重；將一部分軟骨標本處理后進行免疫組化染色，測定Ⅱ型膠原蛋白表達含量情況，用陽性百分率表示；然后將另一部分軟骨標本行HE染色，光鏡下觀察組織形態變化，采用改良Mankin法[9]對結構、細胞、染色以及潮線的完整性進行評分，評分越高說明軟骨退變越嚴重。

1.5 統計學方法

用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用成組設計的q檢驗；組織病理學評分則采用Kruskal-Wallis法檢驗組間差異；以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物一般情況

實驗期間有2只實驗兔有腹瀉癥狀，予土霉素灌胃1～2 d后均好轉；其余實驗兔健康狀況良好。

2.2 軟骨組織大體觀察、Pelletier評分、HE染色、Mankin評分

正常組軟骨結構未見異常，軟骨細胞數目正常，軟骨細胞呈圓形，散在分布，基質染色呈淺紅色，潮線結構穩定；模型組軟骨表面可見不規則裂隙達輻射層，軟骨細胞數目減少、結構紊亂，伴炎癥細胞浸潤，可見簇集樣細胞團形成，局部基質染色變淺，局部可見多重潮線；AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組局部軟骨表面可見不規則裂隙達鈣化層，軟骨細胞數量增多，基質染色呈淺紅色，潮線結構稍正常（圖1）。Pelletier評分和Mankin評分在正常組與模型組，以及正常組、模型組分別與AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組組間比較，差異均有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05），在AEAB組與硫酸氨基葡萄糖組及雙醋瑞因組組間兩兩比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.3 免疫組化測定Ⅱ型膠原蛋白表達含量

正常組Ⅱ型膠原蛋白表達含量與模型組比較差異有高度統計學意義（P < 0.01）。AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組提示Ⅱ型膠原表達量增加，結構紋理清晰，三組與正常組及模型組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。三組兩兩比較差異無統計學意義（均P > 0.05）。見圖2（封三）、表2。

2.4 各組血清和關節液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量比較

正常組血清和關節液中TNF-α、IL-1β以及MMP-3的含量與模型組比較，差異均有高度統計學意義（均P < 0.01）；模型組分別與AEAB組、硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組比較，差異均有高度統計學意義（均P < 0.01），表明三者對兔OA均有較好的治療效果；AEAB組與硫酸氨基葡萄糖組和雙醋瑞因組組間兩兩比較，差異均無統計學意義（均P > 0.05），表明AEAB的治療效果與硫酸氨基葡萄糖和雙醋瑞因相當。見表3～4。

3 討論

目前OA的發病機制尚不十分明確，研究表明，軟骨破壞以Ⅱ型膠原和蛋白多糖破壞丟失最明顯[10]，而軟骨基質中的主要成分Ⅱ型膠原對維持軟骨的生物力學起決定性作用[11]。相關研究表明各種炎性因子在OA發病過程中起到重要作用[12]。近年研究提示MMPs對關節軟骨細胞外基質的損傷是OA發病的“共同通路”[13-14]。MMP-3是MMPs的主要成員之一，其不僅能降解多種基質蛋白底物，更為重要的是MMP-3可激活MMP-1、MMP-9、MMP-13等酶原產生級聯放大效應，加速軟骨破壞[15]。IL-1β和TNF-α是已經被證實在OA的發病中起到重要介導作用的炎性因子[16-17]，具有抑制軟骨合成、加快關節軟骨降解的作用。

牛膝作為中藥治療OA中較為突出的一味，吸引了許多學者對其作用機制進行研究。本課題組前期實驗表明，牛膝能增加兔關節軟骨細胞增殖，提高軟骨Ⅱ型膠原表達，促進骨髓源成體干細胞軟骨分化[4-5]。李成付等[11]通過實驗證實AEAB能降低軟骨CKIP-1、Caspase-3蛋白表達，提高Bcl-2/Bax/Akt蛋白表達，從而促進軟骨修復。

OA動物模型構建的方法有很多種，石膏固定制動制備OA模型，具有簡單易行、無創傷、成功率高等特點，重要的是此法沒有手術創傷的干擾，其病理改變更接近人類OA的發病過程[18]，適用于研究藥物療效及藥物對關節軟骨成分、炎癥介質表達等方面的影響。

本研究發現，AEAB組軟骨細胞數量及Ⅱ型膠原蛋白含量較模型組增多，Pelletier評分和改良Mankin評分明顯降低，軟骨基質結構紋理變整齊，同時發現AEAB能降低血清及關節液中MMP-3、IL-1β、TNF-α的含量，從而減輕其對關節軟骨基質的損害，直接或間接改善軟骨基質代謝，促進軟骨修復，其效果和硫酸氨基葡萄糖及雙醋瑞因無明顯差異，說明AEAB與目前治療OA的西藥代表藥物療效相當，可為其臨床使用提供參考及依據。但是，硫酸氨基葡萄糖與雙醋瑞因存在胃腸道、過敏甚至心血管系統、外周水腫等不良反應[19-20]，而牛膝不但對OA有較好的治療效果，而且根據現代藥理研究[21]，牛膝還有增強免疫力、保肝、護肝、強心、抑制腫瘤轉移等許多有益健康的作用，而其副作用目前尚無報道，因此本研究認為AEAB具有較高的臨床應用價值，同時，其有效成分的篩選、中西藥聯合應用的療效以及干預方式的優化等尚待進一步探索。

[參考文獻]

[1] 楊旦紅，穆懷典，黃俊武.硫酸氨基葡萄糖治療膝骨關節炎的臨床分析[J].中國醫藥指南，2015，13（22）：112-113.

[2] 黃進賢，張會昌，尹志華，等.雙醋瑞因、硫酸氨基葡萄糖聯合玻璃酸鈉治療膝骨關節炎的療效[J].實用醫學雜志，2013，29（22）：3749-3751.

[3] 陳浩雄，徐寧達，彭力平，等.中藥治療膝骨關節炎軟骨修復實驗研究進展[J].現代中西醫結合雜志，2014，23（25）：2843-2845.

[4] 彭力平，馬篤軍，林棟棟，等.牛膝醇提物體內誘導兔骨關節炎模型軟骨修復的病理學觀察[J].湖南中醫雜志，2013，29（2）：126-129.

[5] 彭力平，馬篤軍，裴軍宇，等.牛膝醇提物對急性軟骨損傷兔軟骨的影響[J].中醫雜志，2013，54（17）：1504-1506.

[6] 國家藥典委員會.中國藥典[M].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[7] 曾俊華，馬篤軍，彭力平，等.實驗兔膝骨關節炎模型的建立及鑒定[J].中國臨床研究，2016，29（5）：679-682.

[8] Pelletier JP，Jovanovic D，Fernandes JC，et al. Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase [J]. Arthritis Rheumatol，1998，41（7）：1275-1286.

[9] Mankin HJ，Dorfman H，Lippiello L，et al. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. Ⅱ. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data [J]. J Bone Joint Surg Am，1971，53（3）：523-537.

[10] 張猛，周嘉俊，羅宗平.軟骨損傷后Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的表達[J].中國組織工程研究，2014，18（51）：8305-8309.

[11] 李成付，王玖忠，邊瑜健，等.牛膝醇提物促進兔骨關節炎軟骨修復的作用及其機制的實驗研究[J].中國臨床研究，2015，28（7）：844-847.

[12] 郭偉雄，魏波.炎癥細胞因子及通路在骨關節炎中的研究進展[J].國際檢驗醫學雜志，2015，36（15）：2240-2241.

[13] 陽樂，許鵬.促炎細胞因子與骨關節炎[J].中華骨與關節外科雜志，2015，8（5）：455-459.

[14] Pathak NN，Lingaraju MC，Balaganur V，et al. Anti-inflammatory and chondroprotective effects of atorvastatin in a cartilage explant model of osteoarthritis [J]. Inflammation Res，2015，64（3/4）：161-169.

[15] 賀占坤，沈杰威.MMP-2、MMP-3、MMP-9和TIMP-1評價膝關節骨性關節炎的臨床研究[J].重慶醫學，2013， 42（32）：3872-3874.

[16] Ismail HM，Kazuhiro Y，Vincent TL，et al. Interleukin 1 acts via c-jun N-terminal kinase-2 signalling pathway to induce aggrecan degradation by human chondrocytes [J]. Arthritis Rheumatol，2015，67（7）：1826-1836.

[17] Osta B，Roux JP，Lavocat F，et al. Differential effects of IL-17A and TNF-α on osteoblastic differentiation of isolated synoviocytes and on bone explants from arthritis patients [J]. Front Immunol，2015，6：151.

[18] 陳志達，林瀚洋，余志毅，等.膝骨關節炎動物模型研究進展[J].風濕病與關節炎，2016，5（1）：67-70.

[19] 邱貴興，翁習生，張克，等.鹽酸/硫酸氨基葡萄糖治療骨關節炎的平行對照臨床研究[J].中華醫學雜志，2005， 85（43）：3067-3070.

[20] 瞿雷.雙醋瑞因治療骨關節炎的多中心臨床研究[J].中外醫學研究，2015，13（35）：40-41.

[21] 田碩，苗明三.牛膝的化學、藥理及應用特點探討[J].中醫學報，2014，29（8）：1186-1188.