星點設計—效應面法優化蒼艾油包合物—鼻用溫敏原位凝膠制備工藝

黃秋艷 熊磊 汪紅梅 陳柏君 馬云淑 孔淑君 王輝

摘要：目的 采用星點設計-效應面法優化蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠的制備工藝。方法 以泊洛沙姆407、泊洛沙姆188用量為考察因素，膠凝溫度為評價指標，采用二次多項式模型描述評價指標與2個因素之間的數學關系，以此確定優化處方，并加以驗證。結果 根據二次多項式模型，發現2個考察因素與評價指標之間存在可信的定量關系，其中泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的最佳用量分別為19.37%、2.73%。結論 采用星點設計-效應面法得到了基于二次多項式的蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠處方最優模型，處方工藝穩定可行，實現了該原位凝膠的處方優化。

關鍵詞：蒼艾揮發油；包合物；鼻用溫敏原位凝膠；星點設計-效應面法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.021

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0086-04

Abstract： Objective To optimize the preparation technology of Cangai volatile oil dextrin inclusion compound/ in situ nasal thermosensitive gel by the central composite design-response surface method. Methods In the design， the investigation factors were the amounts of poloxamer 407 and poloxamer 188， and the evaluation index was the gel temperature. Quadratic models were used to evaluate the mathematic relation between the evaluation index and two investigation indexes to identify the optimum prescription， and then the optimum prescription was verified. Results According to the quadratic models， it was found that there was reliable quantitative relation between the evaluation index and two investigation indexes， among which the optimum dosage was 19.37% for poloxamer 407 and 2.73% for poloxamer 188. Conclusion The optimum model of Cangai volatile oil dextrin inclusion compound/ nasal thermosensitive gel can be obtained from central composite design-response surface method based on quadratic models. This method is reliable and feasible， which can realize the prescription optimization of the in situ gel.

Key words： Cangai volatile oil； dextrin inclusion compound； in situ nasal thermosensitive gel； central composite design-response surface method

蒼艾揮發油系以熊磊教授預防上呼吸道感染的臨床效驗方為基礎，選用含揮發油成分較多、氣味清香、抗菌譜廣、抗菌能力強并有一定增強免疫作用的中藥組方[1]。臨床采用鼻腔吸入給藥方式，主要用于肺氣虛證的治療。根據揮發油的性質及給藥方式的特點，本試驗先將其制備成羥丙基-β-環糊精包合物，以降低其揮發性，減小刺激性、提高溶解度及穩定性。此外，綜合歸納影響鼻腔吸收的因素，為保證其在鼻腔吸收完全，將包合物進一步制備成鼻溫敏凝膠（在鼻腔內成為半固體狀態），即能以溶液狀態給藥后，在鼻腔發生相轉變而形成凝膠[2]，增強了與鼻黏膜的親和力，減少藥物流失，延長藥物的滯留時間，增加藥物吸收，提高了生物利用度。不僅可以避開肝臟的首過效應直接進入血液循環，而且可繞過血腦屏障，直接靶向到腦組織。本試驗采用星點設計-效應面優化法[3]，以蒼艾油中主要成分丁香酚為模型藥物，確定鼻用溫敏原位凝膠的最優處方。

1 儀器與試藥

安捷倫1100高效液相色譜儀系統，二極管陣列檢測器（DAD）；HJ-4B型數顯恒溫多頭磁力加熱攪拌器（常州國華電器有限公司）；Sartorius BT25S分析天平（賽多利斯儀器有限公司）；DZFZ-6020真空干燥箱（上海博迅實業有限公司）；SK3300超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；RCZ-1A溶出試驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；Elma超聲儀（型號P180H）；STARTER3100型實驗室pH計（上海奧豪斯儀器有限公司）。

泊洛沙姆407（P407，Pluronic F-127，德國BASF公司，批號50011254），泊洛沙姆188（P188，Pluronic F-68，德國BASF公司，批號50011388），丁香酚（中國食品藥品檢定研究院，批號110725-201213），羥丙基-β-環糊精（TCI化成工業發展有限公司，批號CAS 128446-35-5），娃哈哈純凈水，色譜級甲醇，其他試劑與試藥均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溫敏型空白原位凝膠的制備

精密量取所需純化水，置冰水浴中，放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊緩緩加入準確稱量的P407和P188，分散均勻后，放入4 ℃冰箱中，直至充分溶脹，得澄清透明的空白原位凝膠。

2.2 蒼艾油包合物-溫敏原位凝膠的制備

精密稱取一定量蒼艾油包合物粉末，以適量純水溶解，緩緩滴加到正在攪拌的空白原位凝膠中，即得。

2.3 攪拌子法測定膠凝溫度

取儲存于冰箱中不同濃度的泊洛沙姆凝膠液于西林瓶中，插入溫度計，置于可加熱的磁力攪拌器上，以1 ℃/min緩慢升溫，磁力攪拌子完全停止轉動的溫度即膠凝溫度（Tgel），平行測定3次，取平均值。

2.4 泊洛沙姆407和泊洛沙姆188含量范圍的確定

按“2.1”項下方法，分別制備15%、20%、25%、30% P407溶液及25%、30%、35%、40% P188溶液，按“2.3”項下方法測定，結果見圖1。

經初步考察，確定P407和P188的含量范圍分別為15%～25%和0%～15%。

2.5 處方優化與評價

分別制備不同濃度的P407和P188空白凝膠，觀察濃度與Tgel的關系，根據初步考察結果，采用P407百分含量（X1）和P188百分含量（X2）作為考察因素，確定其范圍。根據星點設計的原理，每因素設置5個水平，用代碼值±α、±1、0來表示，對于二因素的星點設計α=1.414。因素水平見表1。利用Design-Expert8.0.6軟件對各影響因素及評價指標進行二次多項式的數學模型擬合。試驗安排及結果見表2，回歸模型校驗結果見表3。

以P407和P188百分含量為自變量，Tgel為評價指標，進行二次多項式回歸，以擬合優度（R2）及置信度（P）作為模型判定標準。回歸方程為：Tgel=133.417 45-7.695 01X1+1.350 23X2-0.110 67X1X2+0.135 68X12+0.118 08X22（R2=0.990 5，P<0.000 1）。由模型方差分析可以看出，總模型方程高度顯著，模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準確預測實際情況。其校正決定系數（Radj）為0.983 7，表明此模型能解釋98.37%效應值變化，因此該模型擬合程度良好，誤差較小，僅有約2%不能由此模型進行解釋，因此該模型是適合的，可以用此模型對Tgel進行分析與預測。由此可得P407與P188交互作用的響應面圖（見圖2）。最終由軟件分析得到最優處方：P407為19.37%，P188為2.73%。

3 制劑學評價

3.1 體外釋放度試驗

3.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動相：甲醇-水（65∶35）；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 ?L。

3.1.2 線性關系考察 精密稱取丁香酚對照品適量于棕色容量瓶中，加甲醇混勻，制成一定濃度的母液備用。分別吸取丁香酚儲備液適量，加甲醇稀釋成0.04、0.08、0.12、0.16、0.24、0.4、0.8、1.2 mg/mL系列濃度。按“3.1.1”項下色譜條件，各進樣10 μL分析。以峰面積積分值為縱坐標、對照品進樣量（μg）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.926 2X-13.989（r2=0.999 9），結果表明，丁香酚進樣量在0.08～2.4 μg范圍內，與峰面積積分值呈良好的線性關系。

3.1.3 專屬性考察 取丁香酚對照品溶液、凝膠釋放溶液、空白凝膠溶液適量，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果表明，在該色譜條件下，峰形及分離度均良好，見圖3。

3.1.4 實驗方法 按最優處方制備3批蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠，對其進行體外釋放度試驗考察。即按照釋放度測定法（2010年版《中華人民共和國藥典》二部附錄ⅩD第三法），精密稱取蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠5 g（含蒼艾油1.205 ?g），放入處理好的透析袋中，將袋兩端扎緊。以200 mL人工鼻液[3]（精密稱取磷酸二氫鉀13.6 g，加去離子水1 L溶解，用0.1 mol/L溶液調節pH值至6.8）為釋放介質，轉速150 r/min，溫度（37±1）℃，依法操作，于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、30 h分別移取5 mL釋放液經0.45 ?m濾膜過濾備用，并及時補充同溫度的釋放介質5 mL，采用HPLC測定溶出液中的藥物濃度，計算累積釋放百分率（Q）。以體外累積釋放率（%）為縱坐標，取樣時間（h）為橫縱標，繪制釋放曲線。按“3.1.1”項下色譜條件進行試驗，所得3批蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠累積釋放度見表4、圖4、圖5。將所得到的釋放曲線進行零級釋放、一級釋放及Higuchi方程模型擬合，結果見表5。可見，其方程與一級釋放模型擬合相關性最好。

3.2 均一性考察

分別取25 ℃及34 ℃下放置2周的蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠適量，2500 r/min離心15 min，觀察是否出現分層現象。結果表明二者離心后未見分層，且外觀透明、均一。

3.3 pH值測定

取34 ℃下蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠適量于燒杯中，用實驗室pH計進行測定，多次測量得到該凝膠劑的平均pH值為6.91。鼻用制劑的pH值應在5.5～7.5之間[4]，故本制劑符合要求。

3.4 膠凝溫度測定

取“3.1.2”項下3批蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠，按“2.3”項下方法進行膠凝溫度測定，結果見表6。

4 討論

本研究利用星點設計-效應面法得到了蒼艾油包合物-鼻用溫敏原位凝膠的最優處方，且驗證試驗表明，按照最優處方制備的原位凝膠在34 ℃即從溶液態轉變為半固體狀態。從體外釋放曲線可以看出，制備的凝膠在24 h左右釋放了約90%的藥量，通過3種模型擬合后，發現其釋藥過程符合一級釋藥模型，具有一定程度的緩釋作用。此外，其他制劑學評價（包括對均一性、pH值的考察）表明，該制劑符合鼻用凝膠劑的要求。實驗操作中，為減少誤差的產生，在制備凝膠時，應盡量控制于同一臺磁力攪拌器上，采用同一型號、尺寸一致的轉子，相同的轉速以及同一規格的具塞三角瓶進行實驗。此外，與制備空白凝膠時不同，制備含藥凝膠時，在相同處方條件下，隨著藥物加入量的增加，膠凝溫度會隨之升高。可能是用于制備凝膠的包合物粉末存放時間過久，以致出現藥物（揮發油）“泛出”，后加入到空白凝膠中，由于溫度的改變，使溶解度發生變化，從而整個體系的Tgel升高。在綜合考慮膠凝溫度及黏度后，確定了最優處方：P407為19.37%，P188為2.73%。

參考文獻：

[1] 莫悉.蒼艾揮發油對肺氣虛證大鼠免疫調節作用的研究[D].昆明：云南中醫學院，2013.

[2] 頊佳音，楊洪軍，熊欣，等.常見溫度敏感型原位凝膠載體的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（2）：252-257.

[3] 許潤春，林彥君，吳品江，等.中心復合設計-效應面法優化黃芩苷磷脂復合物鼻用原位凝膠的制備工藝[J].中草藥，2012，43（6）：1092-1096.

[4] 張翠霞，張文濤，王東凱，等.新型的藥物傳遞系統——原位凝膠的研究進展[J].中國醫院藥學雜志，2006，26（4）：459-461.