丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)骨髓干細(xì)胞移植急性心肌梗死模型大鼠炎癥反應(yīng)的影響

李鑫輝 李雅婧 黃淼鑫 杜建芳 許福麗 肖青 郭晨鶴

摘要：目的 觀察丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植急性心肌梗死（AMI）模型大鼠炎癥反應(yīng)的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用全骨髓貼壁法結(jié)合密度梯度離心法分離、培養(yǎng)BMSCs。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立AMI模型。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、BMSCs組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+BMSCs組，每組10只。BMSCs細(xì)胞懸液直接注入梗死區(qū)邊緣心肌組織；各組大鼠給予相應(yīng)藥物或生理鹽水灌胃。4周后，ELISA測(cè)定大鼠血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、可溶性細(xì)胞間黏附因子-1（sICAM-1）含量，Western blot測(cè)定心肌組織Toll樣受體4（TLR-4）蛋白表達(dá)，HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)。結(jié)果 與模型組比較，BMSCs組、丹參通絡(luò)解毒湯組、丹參通絡(luò)解毒湯+BMSCs組大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量及心肌組織TLR-4蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.05，P<0.01），且丹參通絡(luò)解毒湯組優(yōu)于BMSCs組（P<0.05，P<0.01），丹參通絡(luò)解毒湯+BMSCs組優(yōu)于BMSCs組、丹參通絡(luò)解毒湯組（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 BMSCs移植聯(lián)合丹參通絡(luò)解毒湯能夠抑制AMI模型大鼠的炎癥反應(yīng)，修復(fù)缺血心肌組織，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TLR-4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：丹參通絡(luò)解毒湯；急性心肌梗死；單核細(xì)胞趨化蛋白-1；可溶性細(xì)胞間黏附因子-1；Toll樣受體4；炎癥反應(yīng)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）11-0057-05

Abstract： Objective To explore the effects of Danshen Tongluo Detoxication Decoction on the inflammatory response of rats with bone marrow stem cell （BMSC） transplantation in acute myocardial infarction （AMI）； To discuss its mechanism of action. Methods The whole bone marrow adherent method was adopted for BMSCs separation and culture. The AMI model was established by closing the left anterior descending coronary artery of SD rats. After the modeling， SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group and BMSCs group （BMSCs transplantation group）， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group， 10 rats in each group. BMSCs cell suspension was injected directly into the edge of the myocardial tissue infarction area； Chinese medicine or normal saline were administered for gavage. 4 weeks later， the contents of MCP-1 and sICAM-1 in each group were detected by ELISA. TLR-4 expression was measured by Western blot method， and HE staining was used to observe the myocardial tissue pathological changes. Results Compared with the model group， the contents of MCP-1 and sICAM-1 and the protein expression of TLR-4 in BMSCs group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， and Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group decreased， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group was better than BMSCs group （P<0.05， P<0.01）， and Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group was better than BMSCs group and Danshen Tongluo Detoxication Decoction group （P<0.05， P<0.01）. Conclusion BMSCs transplantation combined with Danshen Tongluo Detoxication Decoction can restrain the inflammatory response of AMI model rats and repair ischemic myocardium issue， which mechanism may be related to regulating TLR-4 induced inflammatory response.

Key words： Danshen Tongluo Detoxication Decoction； acute myocardial infarction； MCP-1； sICAM-1； TLR-4； inflammatory response； rats

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致死、致殘率逐年增高，成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。近年來(lái)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）因具有取材方便、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、可來(lái)源于自身、應(yīng)用于臨床的可行性高等優(yōu)勢(shì)[1]，成為治療AMI新途徑研究的熱點(diǎn)。研究顯示，BMSCs的應(yīng)用可促進(jìn)心肌組織細(xì)胞再生，刺激梗死區(qū)毛細(xì)血管新生，調(diào)節(jié)梗死區(qū)域心肌組織細(xì)胞的凋亡，改善心臟功能[2]。同時(shí)，有實(shí)驗(yàn)研究表明，中藥干預(yù)BMSCs可調(diào)控BMSCs的歸巢、定植以及分化，抑制BMSCs凋亡，為BMSCs移植提供良好微環(huán)境[3]。丹參通絡(luò)解毒湯由丹參、水蛭、玄參、黃連等配伍組成，全方具有益氣活血、通絡(luò)解毒功效，臨床治療冠心病療效顯著[4]。為研究該方對(duì)AMI后大鼠的抗炎作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法構(gòu)建AMI大鼠模型，觀察丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)大鼠血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、可溶性細(xì)胞間黏附因子-1（sICAM-1）含量及心肌組織Toll樣受體4（TLR-4）蛋白表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

10～12周齡清潔級(jí)SD大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±30）g，用于移植；4～6周幼齡大鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量（100±10）g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（湘）2013-0005。大鼠采用普通飼料飼養(yǎng)，自由飲食，12 h/ 12 h明暗環(huán)境交替。

1.2 藥物

丹參通絡(luò)解毒湯（丹參15 g，檀香10 g，水蛭6 g，川芎10 g，當(dāng)歸15 g，紅花10 g，玄參15 g，黃芩10 g，梔子15 g，黃連6 g，黃芪30 g等），飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，由該院制劑室煎煮，濃縮至含原藥材0.35 g/mL，共350 mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

MCP-1、sICAM-1 ELISA試劑盒、TLR-4單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；Galaxy型CO2培養(yǎng)箱，英國(guó)New Brunswick公司；倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯；多導(dǎo)生理信號(hào)采集系統(tǒng)，成都儀器廠；DW-2000型動(dòng)物人工呼吸機(jī)，上海嘉鵬科技有限公司；mini protean 3 cell型電泳儀，BIO-RAD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備和培養(yǎng)

從4～6周清潔級(jí)雄性SD小鼠股骨的髓腔中收集細(xì)胞，采用全骨髓貼壁法結(jié)合密度梯度離心法進(jìn)行分離、培養(yǎng)。經(jīng)多次換液和消化，將傳至P3的BMSCs采用流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞表面抗原，以CD34陽(yáng)性率低于5%及CD90、CD44陽(yáng)性率高于95%鑒定所得細(xì)胞為高純度的BMSCs。

2.2 造模

參照文獻(xiàn)[5]方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后固定，氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，開(kāi)胸暴露心臟，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳右緣之間交點(diǎn)和心尖的假想連線中下1/3處穿線結(jié)扎。以心電圖出現(xiàn)QRS波群增高增寬伴ST段抬高、心肌組織顏色發(fā)紺為結(jié)扎成功；以結(jié)扎部位以下心肌組織搏動(dòng)減弱、顏色變蒼白，及心電圖顯示肢體Ⅱ?qū)?lián)R波振幅升高、QRS波改變、J點(diǎn)偏移超過(guò)0.1 mV或出現(xiàn)病理性Q波，證實(shí)大鼠AMI造模成功[6]。

2.3 分組及給藥

當(dāng)P3或P4代大鼠BMSCs達(dá)70%～80%融合時(shí)進(jìn)行移植。SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、BMSCs組、丹參通絡(luò)解毒湯組（中藥組）、丹參通絡(luò)解毒湯+BMSCs組（中藥+BMSCs組），每組10只。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，其余各組進(jìn)行AMI造模。BMSCs組和中藥+BMSCs組冠狀動(dòng)脈結(jié)扎30 min后，于心肌梗死區(qū)邊緣心肌組織3個(gè)位點(diǎn)直接注入共100 μL BMSCs細(xì)胞懸液（含細(xì)胞數(shù)3×106），假手術(shù)組和模型組則注入100 μL PBS。術(shù)后各組分籠飼養(yǎng)，給予常規(guī)飼料和飲水，48 h后，每日9：00中藥組和中藥+BMSCs組給予1 mL/100 g丹參通絡(luò)解毒湯藥液灌胃，其余各組用給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d。

2.4 心肌組織病理改變的觀察

術(shù)后4周，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血后，脫頸處死大鼠，迅速取出心臟，用冰生理鹽水沖洗，取左心室缺血處心肌組織置于100 g/L多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚4 μm），HE染色觀察心肌組織的病理改變。

2.5 血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1、可溶性細(xì)胞間黏附因子-1水平測(cè)定

術(shù)后4周，采集大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，3500 r/min離心10 min，取血清，ELISA檢測(cè)MCP-1、sICAM-1水平，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.6 心肌組織Toll樣受體4蛋白表達(dá)測(cè)定

提取心肌組織梗死邊緣區(qū)心肌組織總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電泳后電轉(zhuǎn)于NC膜上，5%脫脂牛奶4 ℃封閉過(guò)夜。孵育TLR-4抗體（1∶500）過(guò)夜。TBST洗滌3次，加入1∶15 000稀釋的熒光二抗，室溫避光孵育2 h，TBST洗滌3次，通過(guò)熒光掃描儀采集信號(hào)，應(yīng)用Quantity One軟件分析計(jì)算灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)或Welch檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)模型大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組心肌組織未見(jiàn)明顯的病理形態(tài)改變，橫紋較清晰；模型組大鼠心肌組織病理形態(tài)改變較明顯，心肌組織間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞腫脹明顯，部分心肌組織細(xì)胞變性、壞死，肌束排列不整齊；干細(xì)胞移植組細(xì)胞腫脹及肌束紊亂程度較模型組減輕；中藥組有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞腫脹輕度，肌束紊亂程度有所改善；中藥+BMSCs組肌束排列較整齊，細(xì)胞腫脹輕度，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)改善，細(xì)胞溶解情況減少。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.2 丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)模型大鼠血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1、可溶性細(xì)胞間黏附因子-1含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量明顯降低（P<0.05），其中，中藥組優(yōu)于BMSCs組，中藥+BMSCs組優(yōu)于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.3 丹參通絡(luò)解毒湯對(duì)模型大鼠心肌組織Toll樣受體4蛋白表達(dá)的影響

假手術(shù)組心肌組織有少量TLR-4表達(dá)，模型組TLR-4表達(dá)明顯增多（P<0.01）；各給藥組較模型組TLR-4表達(dá)明顯減少（P<0.01），其中，中藥組優(yōu)于BMSCs組（P<0.01），中藥+BMSCs組優(yōu)于中藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

5 討論

AMI后，由于組織缺血缺氧等因素激活自身病理性免疫炎癥調(diào)節(jié)系統(tǒng)，誘導(dǎo)心肌組織細(xì)胞壞死、凋亡等梗死后效應(yīng)，機(jī)體為了清除壞死細(xì)胞，又進(jìn)一步激活炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致心肌組織損傷[7]，故通過(guò)調(diào)節(jié)AMI后免疫炎癥反應(yīng)來(lái)減輕心肌組織缺血性損傷十分關(guān)鍵。AMI是一個(gè)急性炎癥過(guò)程，大量實(shí)驗(yàn)研究表明，ICAM-1可以介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的滾動(dòng)和穩(wěn)定黏附，并在MCP-1等炎性因子的協(xié)助下啟動(dòng)局部的炎癥反應(yīng)，AMI后MCP-1、sICAM-1呈高表達(dá)狀態(tài)[8-9]。sICAM-1為ICAM-1在組織損傷后經(jīng)蛋白酶裂解脫落存在于血清中的可溶性形式。TLR-4作為炎性反應(yīng)的跨膜受體，可通過(guò)MyD88依賴性及非依賴性細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)NF-κB早期及晚期的活化，致使ICAM-1的表達(dá)量上調(diào)[10]，并促使MCP-1等趨化因子的合成及釋放，開(kāi)啟炎癥反應(yīng)。因此，TLR-4與sICAM-1、MCP-1關(guān)系密切，都參與AMI過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMI后大鼠心肌組織TLR-4表達(dá)增加，而血清sICAM-1、MCP-1水平也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示AMI可能通過(guò)TLR-4激活核因子-κB，從而誘導(dǎo)sICAM-1、MCP-1的表達(dá)和釋放，參與AMI的病理過(guò)程。

BMSCs是一種存在于骨髓組織中具有自我增殖及能分化為心肌組織細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞潛能的多能干細(xì)胞。無(wú)論是在動(dòng)物模型研究還是臨床前試驗(yàn)中，通過(guò)BMSCs移植治療缺血性疾病都取得了顯著的成果[11-12]。有研究顯示，BMSCs不僅具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，還能在移植后在宿主體內(nèi)存活并對(duì)AMI后病理性免疫反應(yīng)起到一定的調(diào)節(jié)作用。中藥干預(yù)BMSCs移植可促進(jìn)BMSCs的歸巢、定植及分化，為BMSCs移植提供良好微環(huán)境，從而提高移植后的成活率，增強(qiáng)對(duì)缺血心肌組織的保護(hù)作用[13]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，疏肝活血中藥可以改善BMSCs移植IRI大鼠心肌病理形態(tài)和心功能[14]，益氣活血方對(duì)骨髓干細(xì)胞具有動(dòng)員作用[15]。

冠心病屬中醫(yī)學(xué)“心痛”“胸痹”“真心痛”等范疇，其發(fā)病主要是由于六淫犯心、七情內(nèi)傷、飲食不節(jié)、年老體弱等致心臟的陰、陽(yáng)、氣、血虧損，痰濁、瘀血、氣滯、寒凝等阻于心絡(luò)。然而，外邪和內(nèi)邪在機(jī)體中積聚日久，逐漸蘊(yùn)積成毒，毒損心絡(luò)，導(dǎo)致心絡(luò)不通，即使心肌組織再灌注治療血液再通，但缺血心肌組織原有代謝毒物未能排出，再灌注產(chǎn)生的氧自由基和炎癥因子等新的“濁毒”對(duì)心體的損害又進(jìn)一步加重。丹參通絡(luò)解毒湯是多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、玄參、黃芩、水蛭、川芎等組成，方中丹參主要有效成分丹參酮和丹酚酸具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、防止心肌組織缺血和心肌梗死、改善微循環(huán)、降低心肌組織耗氧量、抑制炎癥反應(yīng)等作用[16]；川芎有效成分川芎嗪可改善冠狀動(dòng)脈的血液循環(huán)，減輕心肌組織缺血后心肌組織細(xì)胞損傷，減少梗死面積[17]；玄參提取物降低炎癥細(xì)胞因子過(guò)量表達(dá)，對(duì)心肌組織具有明顯保護(hù)作用[18]；黃芩有效成分黃芩素、黃芩苷具有抗氧化、清除自由基的作用，從而修復(fù)損傷心肌組織[19]。全方具有益氣活血、通絡(luò)解毒的功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方能有效降低AMI大鼠血清sICAM-1、MCP-1含量，減少心肌組織TLR-4的表達(dá)，明顯改善心肌組織病理形態(tài)，提示丹參解毒通絡(luò)湯可能通過(guò)抑制TLR-4激活，減少sICAM-1、MCP-1的表達(dá)和釋放，從而抑制AMI后的炎癥反應(yīng)，修復(fù)心肌組織損傷。并且，丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合干細(xì)胞移植對(duì)大鼠AMI后干預(yù)作用較單純丹參通絡(luò)解毒湯和單純干細(xì)胞移植干預(yù)作用更為顯著，提示丹參通絡(luò)解毒湯與BMSCs移植的聯(lián)合作用，可以通過(guò)抑制TLR-4激活，增強(qiáng)對(duì)梗死心肌局部炎癥的抑制作用，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)梗死心肌的修復(fù)作用，減輕心室重構(gòu)。

綜上所述，丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合干細(xì)胞移植可以抑制大鼠AMI后炎癥反應(yīng)，改善急性心肌組織缺血大鼠的心肌損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TLR-4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

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