體外高通量評價過敏反應模型的建立及其對潛在過敏原異蓮心堿的評價研究

王莉 劉青 王石峰 俞洋洋 孫圣楠 蔣俊 史新元 栗世鈾

摘要：目的 建立體外高通量評價過敏反應模型，并對中藥單體化合物進行篩選，從而確定其中的潛在過敏原。方法 建立穩定表達MrgX2的高通量藥物篩選細胞模型。首先將重組質粒pmCherry-C1-MrgX2轉染人胚腎HEK293細胞，通過G418篩選建立穩定表達人MrgX2的細胞株；再通過MrgX2特異性激動劑C48/80和拮抗劑2-APB檢測細胞株的功能和穩定性，以Z因子確認高通量體系的穩定性和可靠性。采用上述模型對180個單體化合物進行篩選，以EC50、IC50、特異性及毒性確定該激動劑的功能性。結果 MrgX2細胞模型對特異性激動劑C48/80和特異性拮抗劑2-APB的EC50和IC50分別為2.7 ?g/mL和46.29 ?mol/L，MrgX2細胞模型第1代和第20代對激動劑的反應基本一致，該模型Z因子為0.78。篩選得到異蓮心堿為陽性激動劑，其功能驗證結果為：EC50為4.5 ?mol/L、IC50為39.47 ?mol/L，只能特異性激動MrgX2受體，且無細胞毒性。結論 采用鈣流方法可成功構建基于過表達細胞系HEK293/MrgX2的體外高通量評價過敏反應模型，并且初步確定異蓮心堿為潛在引發過敏反應的過敏原。

關鍵詞：MrgX2；過敏反應評價方法；高通量；鈣流檢測；異蓮心堿

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.013

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0051-06

Abstract： Objective To establish a high-throughput evaluation model for anaphylactic reactions； To screen and identify potential anaphylactogens from TCM monomeric compounds. Methods Cell model of stably expressed MrgX2 was established. Recombinate plasmid pmCherry-C1-MrgX2 was transfected to HEK293 to establish cell line for screening model. MrgX2 agonist and antagonist were used to identify the validation and stability of the cell line. A small library consisting of 180 compounds was profiled by using a cell-based calcium mobilization assay to find novel compounds targeting the MrgX2 receptor. EC50 test， IC50 test， specificity validation and cytotoxicity evaluation were carried out to detect the function of the positive agonist. Results The EC50 of C48/80 to MrgX2 model was 2.7 ?g/mL and the IC50 of 2-APB （evoked by 10 ?g/mL C48/80） was 46.29 ?mol/L. The first generation cell model of MrgX2 was similar to the 20th generation， and the Z factor of MrgX2 cell model was 0.78. In the primary screening for agonist， isoliensinine was identified as a novel agonist targeting receptor MrgX2 with an EC50 of 4.5 ?mol/L and IC50 of 39.47 ?mol/L. Moreover， isoliensinine was validated to activate MrgX2 receptor specifically without cytotoxicity. Conclusion A high-throughput evaluation method for anaphylactic reactions can be established in vitro through calcium mobilization assay. A potential anaphylactogen isoliensinine is identified and validated.

Key words： MrgX2； evaluation method for anaphylactic reactions； high throughput； calcium mobilization assay； isoliensinine

隨著中藥臨床應用的日益增長，中藥安全性“事件”時有發生[1]，尤其中藥注射劑的臨床安全性問題倍受關注[2]。目前過敏反應評價方法分為體內法和體外法。體內法存在主觀性強、周期偏長、不適合大規模藥物篩選等缺點[3]；體外法通常具有假陽性率高、人鼠種群的差異性等缺點[4]。因此，建立一種快速、準確的過敏反應檢測方法勢在必行。研究表明，MrgX2受體在過敏和慢性炎癥中發揮著重要作用[5]。約翰霍普金斯大學研究人員確定MrgX2受體將是解決藥物過敏反應的極其重要的靶點[6]。本研究建立基于過表達MrgX2的重組細胞系鈣流高通量篩選方法，并應用所建模型對180個中藥化合物進行篩選，以期對潛在致敏物質進行早期預測。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

重組質粒pmCherry-C1-MrgX2，Genewiz；人胚腎HEK-293細胞，中國科學院精準基因組醫學重點實驗室；二甲基亞砜（DMSO）培養基和胎牛血清（FBS），Gibco BRL；ATP、G418、C48/80、Probenecid、acid red 1、2-氨基乙氧基聯苯硼酸鹽（2-APB）及DMEM，Sigma-Aldrich；Matrigel基質，Becton Dickinson；鈣離子指示劑Fluo-4/AM，Molecular Probes；96孔黑壁透明底板，Costar；180個中藥單體化合物（純度>98%），中國科學院精準基因組醫學重點實驗室；CellTiter-Glo?發光法細胞活力檢測試劑盒，Promega。

1.2 儀器

FLEX Station Ⅱ熒光成像分析系統，Molecular Devices。

2 實驗方法

2.1 穩定細胞系的構建

HEK293細胞于37 ℃、5%CO2孵箱中培養至狀態良好，將構建的含有抗性標記的MrgX2真核表達質粒pmCherry-C1-MrgX2轉染入HEK293細胞。轉染24 h后，將細胞以1∶30、1∶40和1∶50比例稀釋并傳代至6 cm培養皿，培養約2～3 d，待細胞狀態穩定后，加入終濃度為800 ?g/mL選擇培養基進行篩選。約2周后，直至未轉入質粒的HEK293細胞全部死亡，進行單克隆細胞系的挑選并進行擴大培養。隨后，通過檢測單克隆細胞對MrgX2特異性激動劑C48/80的鈣流信號進行陽性單克隆的篩選，再轉入400 ?g/mL G418培養液擴大培養，進行下一步研究。

2.2 鈣流檢測方法

HEK293/MrgX2（P6-P8）以36 000/孔密度接種于Matrigel包被的96孔黑壁透明底板，置于37 ℃孵箱中培養過夜。測試前移除培養基，每孔加100 ?L loading buffer（含4 ?mol/L Fluo-4/AM和2.5 mmol/L probenecid的HBSS）。細胞置于5%CO2、37 ℃培養30 min。通過鈣離子指示劑Fluo-4/AM進行鈣流檢測，FLEX Station熒光成像分析系統獲得數據（λexcitation=485 nm，λemission=525 nm）。于化合物板中配制5×測試濃度的激動劑，通過機器加樣，瞬時鈣流信號被FLEX Station熒光成像分析系統捕獲，采集數據直至80 s。抑制劑檢測采用二次加樣方式，在進行鈣流熒光檢測前10 min中加入拮抗劑（5×待測濃度），避光孵育10 min后開始檢測，激動劑采用機器加樣，并采集數據至80 s。為評價高通量篩選體系的穩定性和可靠性，需進行Z因子檢測，陽性對照（40 ?g/mL C48/80）與陰性對照（0.25%DMSO）在同一96孔板中進行鈣流檢測。在進行細胞系穩定性的驗證時，每隔5代進行激動劑C48/80對HEK293/MrgX2激動作用的劑量依賴曲線，并比較EC50的差異性。在進行激動劑的初篩時，與陽性對照C48/80比較，激動效應超過50%才被初步認定為陽性激動劑。在進行陽性激動劑EC50與IC50的檢測時，所有濃度均進行復孔檢測。

2.3 化合物準備

用DMSO將中藥化合物溶解，并以36 mmol/L濃度保存。初篩前，用DMSO將化合物從36 mmol/L稀釋至4 mmol/L，拮抗劑2-APB也以4 mmol/L濃度進行短暫保存。初篩時，將化合物用HBSS稀釋400倍至終濃度10 ?mol/L（DMSO終濃度為0.25%），陽性對照為10 ?g/mL C48/80（HBSS稀釋），陰性對照為0.25%DMSO。在本實驗室已經進行對包括G蛋白偶聯受體（GPCR）在內的藥物靶體所進行的篩選中，均從這個天然產物庫中找到了先導化合物，充分證明了其可用性與多樣性[7-8]。

2.4 特異性及受體選擇性

為了檢測陽性激動劑能否使HEK293細胞系產生鈣流信號值，HEK293被一系列不同濃度的陽性化合物刺激，同時，5 ?mol/L ATP和0.25%DMSO分別用作陽性對照和陰性對照，按照鈣流實驗中激動劑的檢測方法進行檢測。

穩定表達TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、T2R以及ETB受體的重組細胞系由中國科學院北京基因組研究所提供。這些細胞系已經過已知激動劑和拮抗劑的驗證，確保其功能性和檢測體系的可靠性。這些重組細胞系以36 000/孔密度鋪于matrigel包被的96孔黑色透明板，置于5%CO2、37 ℃孵箱中培養過夜，應用鈣流檢測方法來檢測陽性化合物對這些受體的激動作用，陽性化合物終濃度為10 ?mol/L。HEK293細胞組作為空白對照。

2.5 毒性檢測

應用熒光素酶耦合檢測方法檢測陽性化合物異蓮心堿的毒性。HEK293/MrgX2以1000/孔密度接種于96孔板，5%CO2、37 ℃孵箱中過夜培養。第2日，每孔移除20 ?L培養基，并加入不同濃度的化合物（濃度梯度與測定EC50時相同），5%CO2、37 ℃孵箱中孵育2 h，CellTiter-Glo試劑孵育10 min，隨后用Envision2100進行細胞活力的檢測。0.25%DMSO作為陰性對照。

3 統計學方法

鈣流結果轉化為相對熒光單位（RFU），RFU最大值用于繪制劑量依賴曲線，EC50、IC50、Z因子由GraphPad Prism軟件獲得。所有數據均為3個獨立實驗結果的平均值，不同組間比較采用單因素方差分析進行。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 體外高通量評價過敏反應模型構建

4.1.1 穩定細胞系的構建 將構建的帶有紅色熒光標簽的重組質粒pmCherry-C1-MrgX2轉染HEK-293 細胞，經G418篩選后共獲得46個單細胞克隆。用10 ?g/mL陽性激動劑進行刺激，通過鈣流方法檢測激活鈣流信號強弱挑選MrgX2高表達克隆，共挑選得到16株陽性單克隆細胞系。最終挑選信號值最穩定、最強的6號單克隆作為高通量篩選的穩定細胞系，命名為HEK293/MrgX2，轉入400 ?g/mL G418進行后續研究。

4.1.2 細胞系功能性與穩定性驗證 為了應用HEK/MrgX2重組過表達細胞系進行MrgX2受體激動劑的篩選，首先應通過陽性激動劑C48/80以及拮抗劑2-APB進行細胞系功能性和實用性驗證。由圖1A可知，C48/80對細胞系具有明顯的激動作用且表現出明顯的劑量依賴效應，EC50為2.7 ?g/mL，2-APB是 MrgX2的抑制劑，可阻斷其通道的功能，抑制鈣離子的通過。由圖1B可知，其對由C48/80引起的鈣流信號具有明顯的抑制作用且IC50為46.29 ?mol/L，結果與文獻報道基本一致[6，9]。隨后，為檢測重組細胞系HEK293/MrgX2的穩定性，將HEK293/MrgX2細胞培養至25代以上，并且同時檢測C48/80在P0、P10、P20代HEK293/MrgX2細胞的激動作用并計算EC50，由圖1C可知，得到的EC50值無明顯變化。

4.1.3 鈣流篩選體系穩定性驗證 采用Z因子評價篩選體系的穩定性。通常Z因子值>0.5時，則該體系適用于高通量篩選。40 ?g/mL C48/80和0.25%DMSO作為陽性對照和陰性對照，HEK293/MrgX2細胞系進行48孔刺激和48孔陰性對照，利用Z因子算法，建立的2個篩選系統Z因子值為0.78，結果見圖2。結果表明本實驗建立的篩選系統可靠、穩定。

4.2 中藥化合物篩選

應用基于過表達細胞系HEK293/MrgX2的高通量篩選模型進行180個中藥單體化合物（10 μmol/L）激動效果的評價，與陽性對照C48/80比較，當化合物激動效應>50%時，可初步判定為陽性激動劑。結果見圖3。異蓮心堿（isoliensinine）被挑選出來進行進一步的驗證研究。

4.3 陽性化合物驗證

4.3.1 陽性化合物功能性驗證 為獲得陽性激動劑劑量反應，檢測不同濃度異蓮心堿對HEK293/MrgX2的激動效應。結果顯示，其激動效應呈現明顯的劑量依賴趨勢，且EC50為4.5 ?mol/L；2-APB是MrgX2受體的拮抗劑，用系列濃度2-APB拮抗10 ?mol/L異蓮心堿引起鈣流信號，計算得到IC50為39.47 ?mol/L。結果見圖4。

4.3.2 特異性以及受體選擇性驗證 假陰性結果是高通量篩選的主要問題。若一個化合物能同時激動HEK293/MrgX2細胞系和HEK293母細胞系，則這個化合物就被看作假陽性激動劑。ATP可激動絕大多數細胞系，它通過激動P2Y受體來產生鈣流信號[10]。為了排除假陽性結果的可能性，用異蓮心堿作用HEK293母細胞系，以5 ?mol/L ATP和0.25%DMSO被用作陽性對照和陰性對照。結果顯示，異蓮心堿對HEK293的作用與陰性對照的結果無顯著差異，表明異蓮心堿激活的是MrgX2受體，排除了其為假陽性的可能性，見圖5。MrgX2是GPCR大家族的一個成員，為了驗證異蓮心堿對MrgX2激動效應的特異性，檢測了異蓮心堿對TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、Tas2R以及ETB的激動效應。結果顯示，異蓮心堿對這些GPCR受體無激動效應。

4.3.3 細胞毒性的驗證 為了確定異蓮心堿對HEK293/MrgX2細胞系是否具有毒性，應用酶聯熒光方法進行毒性檢測。不同濃度異蓮心堿作用下細胞活力與陰性對照組0.25%DMSO比較差異無統計學意義，見圖6。因此異蓮心堿對HEK293/MrgX2細胞系的細胞活力沒有影響，即異蓮心堿無細胞毒性。

5 討論

中藥的過敏反應已成為制約中藥發展和應用的重要因素，因此進行中藥的質量控制顯得尤為重要。目前，中藥質量控制中缺乏較為靈敏簡便以及高通量評價過敏反應的方法[11]。MrgX2是引發過敏反應重要的潛在靶點，在預測過敏原起到重要作用。因而，在中藥過敏性評價、過敏原篩查中可起到關鍵作用。

高通量藥物篩選是發現特異性配體的一種高效率的手段，保證篩選體系的穩定性和可靠性是其關鍵性環節。由于MrgX2受體可與Gq蛋白耦聯，引起細胞內鈣流的變化，本研究建立了一種基于細胞內鈣流測定的方法來建立篩選模型。基于細胞的方法可以展現豐富的待測化合物的功能性信息，因此在新藥篩選過程中被廣泛的應用。基于flexstation Ⅱ的鈣流篩選方法可以實現自動加樣以及高通量，大大地提高了新藥發現的效率[12-13]。研究結果表明，該方法快速、靈敏、穩定性高，適合于高通量篩選。特異性與穩定性是高通量篩選模型的基本要求，特異性是陽性化合物對受體的特異性結合與反應，而穩定性是細胞穩定表達受體。本研究通過檢測模型對其特異性激動劑C48/80濃度依賴反應來確定模型的特異性，繼而通過檢測細胞在20代之后對配體濃度依賴的反應來確定其穩定性。Z因子是評價一個篩選方法質量的可靠參數，通常來說，Z因子值>0.5時即可判定這個方法體系具有足夠的穩定性來進行高通量篩選[14]。本實驗Z因子值為0.78，說明此篩選體系具備較高的篩選質量。假陽性是高通量篩選的主要問題，為了解決這一問題，采用不含MrgX2受體的HEK293細胞進行陽性化合物異蓮心堿的驗證，并采用其余6個GPCR（TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、Tas2R和ETB）對異蓮心堿進行驗證，結果表明異蓮心堿是MrgX2的特異性激動劑。

異蓮心堿是從睡蓮科蓮屬植物蓮成熟種子的綠色幼葉及胚根中分離的一種雙芐基異喳琳生物堿單體[15]。研究表明，異蓮心堿具有改善心血管功能、降壓、抗心律失常、抗心肌缺血、改善急性肺損傷和肺纖維化、抗血小板聚集和抗凝血、抗氧化、清除自由基等功效[16-17]。但是，尚未見到有關異蓮心堿在免疫系統發揮作用的文獻報道。本實驗結果顯示，異蓮心堿可能會在機體內引發過敏反應，為異蓮心堿的安全應用提供新的依據。

綜上所述，本研究建立了一種體外高通量評價過敏反應的方法，并且篩選得到異蓮心堿為潛在的能引發機體產生過敏反應的過敏原。此外，從分子靶點的層面解釋了異蓮心堿對免疫系統的影響。

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