UPLC法測定不同來源及其部位苦楝皮中川楝素的含量

王遠敏，吳紅梅＊，王祥培，馮 華，潘成莉，楊留波

（1.貴陽中醫學院，貴州 貴陽550002；2.貴州省遵義市食品藥品檢驗所，貴州 遵義563002）

苦楝皮為楝科植物川楝（MeliatoosendanSieb.et Zucc.）或楝（MeliaazedarachL.）的干燥樹皮和根皮。始載于《證類本草》。具有清熱、燥濕、殺蟲的功效，用于蛔蟯蟲病、蟲積腹痛、疥癬瘙癢等癥的治療[1]。苦楝皮藥材中主要含有川楝素、苦楝萜酮內酯、苦楝皮萜酮、苦楝萜酸甲酯、4，8－二羥基－1－四氫萘醌和兒茶素等化合物[2－6]。苦楝皮為多基源藥材，市場上的苦楝皮藥材包括川楝或楝的莖皮、枝皮、根皮等。楊燁[7]等比較了同植株不同部位來源的苦楝皮的揮發性成分發現，不同部位的揮發性成分存在差異，而不同品種、不同部位的苦楝藥材中川楝素是否存在差異，目前未見文獻報道，不利于苦楝藥材資源的開發和合理利用。川楝素是從楝科植物川楝子和苦楝皮中提取的一種呋喃三萜類化合物，具有驅蟲、抑制神經遞質、抗肉毒等多種生物活性[8]，也具有抑制實體腫瘤體外增殖和誘導凋亡等作用，是治療前列腺癌、神經母細胞瘤、肺腺癌、乳腺癌等實體腫瘤的活性成分[9－10]，且在2010版藥典以川楝素為控制苦楝皮藥材質量的指標，故試驗以川楝素的含量為指標，建立川楝素高效、快速、簡單的含量測定方法，并評價同植株不同部位來源的苦楝皮藥材質量，以期為苦楝皮藥材的質量控制、資源的合理開發利用及臨床使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材、儀器與試劑

藥材：川楝素對照品（批號：MUST－14031503，成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%），26批苦楝根皮、莖皮、枝皮來自不同的地區和藥店，包括湖北省、貴州省天柱縣清浪村、貴州省麻江縣黃壩村、貴州省貴陽市花果園藥材市場、貴州省開陽縣上壩、貴州省黔西縣重新鎮、貴州省龍里縣灣寨鄉、貴州省貞豐縣者相鎮、四川省新都區斑竹園、貴州省貴陽市南明區省委、貴州省六盤水市六枝特區蟠龍、貴州省貴陽市藥用植物園、云南省保山市一心堂藥房、四川省成都市杏林大藥房、湖南省長沙青蘋果健康藥房，并干燥、粉碎，經貴陽中醫學院王祥培教授鑒定為楝科楝屬植物川楝或楝的干燥樹皮和根皮。

儀器：Agilent1290超高效液相色譜儀（美國），帶有四元泵溶劑洗脫系統、柱溫箱、自動進樣器；AL204－IC／萬分析天平（METTLERTOLEDO 儀器有限公司），HS－10260T 超聲波清洗機（天津市恒奧科技發展有限公司），HH－6數顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）。

試劑：乙腈為色譜純（美國TEDTA 公司），水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2 供試品與對照品溶液的制備

將不同來源苦楝藥材粉碎，過4號篩，取粉末約0.5g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷。再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，用0.22μm 的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

精密稱取川楝素對照品適量，置于25mL 的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成0.448mg／mL的對照品儲備液。精密量取5mL儲備液于10mL的容量瓶中，加甲醇定容，制備成0.224mg／mL 的對照品溶液。

1.3 色譜條件的考察

在色譜分離過程中考察乙腈－水、乙腈－0.01%甲酸水、甲醇－水等流動相系統，選擇川楝素分離效果好的洗脫條件進行洗脫，考察不同流速（0.1mL／min，0.15mL／min，0.2 mL／min）對峰分離效果的影響，考察柱溫（20℃，25℃，30℃，35℃）對分離度效果及分析時間的影響，考察DAD 檢測器和ELSD檢測器的靈敏度。

1.4 系統適應性試驗

在最佳色譜條件下，分別吸取對照品溶液和供試品液注入液相色譜儀，考察川楝素對照品及樣品與鄰近峰的分離度及川楝素的理論塔板數。

1.5 線性關系與方法學考察

線性關系：分別取對照品溶液0.2μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL和3.5μL注入液相色譜儀。以峰面積為縱坐標（Y），樣品含量為橫坐標（X）制作工作曲線。

精密度：精密吸取對照品溶液1μL，重復進樣6次，并計算川楝素的保留時間及峰面積的RSD值。

穩定性：取供試品溶液2μL，分別于0h，2h，4h，6h，8h，10h和12h進樣測定，記錄和計算川楝素的保留時間及峰面積的RSD值。

重復性：取四川省成都市杏林大藥房的莖皮粉末（過4號篩）6份，精密稱取0.5g，按1.2制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，計算川楝素含量的平均值及RSD值。

1.6 加樣回收率試驗

精密稱取采于四川省成都市杏林大藥房的莖皮粉末（過4號篩）6份，每份約0.25g，置于圓底燒瓶中，加入適量的川楝素對照品儲備液，按1.2制備供試品溶液，按上述的色譜條件進行測定，計算回收率。

1.7 樣品川楝素的含量測定

取26批不同來源的苦楝皮藥材，按1.2制備供試品溶液，在最佳色譜條件下測定，記錄色譜峰，以川楝素對照品作為對照，并計算川楝素的含量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件

經試驗表明，在色譜柱為Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1×100 mm，1.8μm），流動相乙腈－水（34∶66），流速0.10 mL／min，柱溫30℃，DAD 作為檢測器，波長210nm，對照品進樣量為1μL，樣品進樣量為2μL 時的分離效果最好，儀器靈敏度較高。

2.2 系統適應性試驗

由圖示可知，在對照品和供試品保留時間相應的位置都具有川楝素的色譜峰，且在供試品中的川楝素色譜峰不受其他峰的干擾。川楝素對照品結構中具有半縮醛結構，始終有2 個互變異構體存在。因此，試驗以川楝素2個峰面積之和計算。川楝素與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論塔板數按川楝素峰計算不低于8 000。

圖示 川楝素對照品和苦楝皮藥材供試品的UPLC色譜圖Fig.The UPLC chromatogram of M.toosendanand M.azedarach

2.3 線性關系與方法學考察

由工作曲線得到川楝素的回歸方程為y＝669.96x＋0.8195（R＝0.999 6）。川 楝素在0.044 8～0.784 0μg有良好的線性關系。

在同一臺儀器上檢測，其穩定性、精密度、重復性試驗中的川楝素的保留時間和峰面積的RSD值分別為2.77%、1.67%和2.60%，且重復性試驗計算四川省成都市杏林大藥房的莖皮的川楝素含量為為11.58mg／g，RSD值為2.6%。表明，儀器的穩定性、精密度、重復性好。

2.4 加樣回收率

由表1 可知，苦楝皮中川楝素的回收率在95%～105%，表明，試驗結果準確、可靠。

2.5 不同來源苦楝皮中的川楝素含量

由表2可知，樣品1～4、5～8、9～26為根皮、莖皮、枝皮部位，3個部位川楝素的含量都有差異。其中，18批莖皮的最高含量為2.22%，而最低含量為0.16%，兩者相差10倍以上，差異較大，可能是受到產地、海拔、土壤、采收時間的影響；樣品1、5、9，2、6、10，3、7、11，4、8、12來源于同植株的不同部位，其川楝素的含量差異也較大，但川楝素的含量都以根皮＞莖皮＞枝皮的順序排列，顯示次生代謝產物川楝素在植物根皮、莖皮、枝皮的分布極不均勻，表現出該成分由下至上的分布和積累趨勢，同時也說明川楝素的含量可能受水分、無機鹽、土壤等因素的影響。

表1 苦楝皮中川楝素的加樣回收率Table 1 The recovery rates of M.toosendanand M.azedarach

表2 不同來源與部位的苦楝皮中川楝素的含量Table 2 Toosendain content in different source and part of M.toosendanand M.azedarach %

3 結論與討論

試驗表明，在色譜柱為Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1×100 mm，1.8μm），流動相為乙腈－水（34∶66），流速為0.10 mL／min，檢測波長為210 nm，柱溫為30℃，川楝素在0.044 8～0.784 0μg的線性良好，平均加樣回收率為97.03%，RSD小于3%（n＝6），測定方法精確、可靠。

試驗測定了共18批楝莖皮中川楝素的含量，結果發現各批次楝莖皮部位的川楝素含量差異較大，其中以貴州省天柱縣清浪村的川楝素含量最高，為2.22%，貴州省開陽縣上壩的川楝素含量最低，為0.16%，兩者相差10倍以上。而不同產地的相同部位如根皮、枝皮中川楝素的含量差異也較大。提示苦楝皮川楝素的含量受藥材產地、采收時間、加工炮制和土壤等因素的影響較大，故臨床上使用苦楝皮藥材時應注意影響其質量的因素，確保臨床用藥的安全有效。

考慮到不同植株同一采收期的含量有差異，為避免不同植株間的川楝素含量的差異，試驗以楝同一植株進行不同部位的采樣，以減少誤差。通過測定湖北、貴州麻江黃壩村、貴州天柱縣清浪等4個產地共12批同植株不同部位藥材中川楝素含量發現，同植株不同部位藥材川楝素的含量差異較大，都以根皮＞莖皮＞枝皮的順序排列，說明川楝素在植株不同部位的代謝積累極不均勻，具有部位的選擇性，可能受水分、無機鹽、土壤等因素的影響，且根皮、莖皮、枝皮川楝素的含量符合或超過藥典范圍，從資源利用與保護角度，建議藥材來源以枝皮為主。

2010 版藥典規定，川楝素的含量應該在0.01%～0.22%，從收集到的26批藥材來看，有5批藥材在藥典范圍內，21批藥材川楝素的含量都高于此范圍。雖然川楝素是苦楝皮藥材的主要藥理活性成分，但已有研究證明川楝素可引起較嚴重的急性消化道不良反應，還可發生急性中毒性肝炎，出現轉氨酶升高、黃疸、肝大叩痛等癥狀[11]。提示以楝的根皮、莖皮、枝皮作為苦楝皮藥材來源，內服給藥時應注意控制其質量，保證臨床用藥的安全性。

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