支氣管內超聲引導針吸活檢標本檢測3種microRNA對肺癌分型的價值

李璽，林勁松，陳桂陽，陳明真，盧燕珊，榮福

（廣東省佛山市順德區第一人民醫院 呼吸內科，廣東 佛山 528300）

支氣管內超聲引導針吸活檢標本檢測3種microRNA對肺癌分型的價值

李璽，林勁松，陳桂陽，陳明真，盧燕珊，榮福

（廣東省佛山市順德區第一人民醫院 呼吸內科，廣東 佛山 528300）

目的 探討支氣管內超聲引導針吸活檢術（EBUS-TBNA）獲取標本聯合檢測3種microRNA對肺癌分型的價值。方法 收集2014年10月-2016年1月在該院住院的肺癌患者35例，同期收集肺部良性病變者20例為對照組，經EBUS-TBNA獲取標本，用實時定量PCR方法檢測其miRNA-21、miRNA-205、miRNA-375的表達水平，評價其在肺癌病理分型的價值。結果 肺癌組EBUS-TBNA標本miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（均P ＜0.01）。miRNA-21在腺癌患者EBUS-TBNA標本中的表達水平明顯高于肺鱗癌，差異有統計學意義（P ＜0.05）；miRNA-205在肺鱗癌患者EBUS-TBNA標本中的表達水平明顯高于肺腺癌，差異有統計學意義（P ＜0.05）；miRNA-375在小細胞肺癌患者EBUS-TBNA標本中的表達水平明顯高于鱗癌和腺癌，差異有統計學意義（P ＜0.01）。根據受試者工作特征曲線（ROC），miRNA-21取1.955為診斷肺腺癌的臨界值時，其敏感度和特異度分別為65.00%和100.00%；miRNA-205取2.305為診斷肺鱗癌的臨界值時，其敏感度和特異度均分別為91.67%和100.00%。結論 EBUS-TBNA標本行miRNA檢測是可行的，聯合檢測miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375有助于肺癌的診斷和病理分型。

支氣管內超聲；經支氣管針吸活檢；微小RNA；肺癌；診斷；分型

2015年我國估算有73.3萬例新發肺癌病例和60.0萬例死亡病例，居惡性腫瘤發病率和死亡率的首位，與美國相比，中國肺癌的預后更差、生存期更短［1］。支氣管內超聲引導針吸活檢術（endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA）是臨床上常用的細針穿刺技術，對肺癌的診斷有良好的價值且安全性較好［2］。但在所有的肺癌小標本中，診斷為非小細胞癌組織學亞型不明確（non-small cell carcinoma not otherwise specified，NSCC-NOS）約占30.00%～50.00%，隨著分子靶向治療的發展，世界衛生組織建議減少NSCC-NOS的診斷［3］。目前大量研究表明，微小RNA（microRNA）有助于肺癌分型［4］。本研究收集中低分化肺癌患者經EBUS-TBNA獲取的小標本，通過實時定量PCR方法檢測其miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375，探討miRNA在肺癌病理分型中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料

所有研究對象均為2014年10月-2016年1月在廣東省佛山市順德區第一人民醫院住院肺癌患者（肺癌組）35例。其中，男24例，女11例；年齡33～75歲，平均年齡（59.71±9.88）歲；鱗癌12例，腺癌20例，小細胞肺癌3例。所有肺癌患者檢查前均未行放化療或靶向治療。同期收集有肺部良性病變且無腫瘤病史的患者（對照組）20例。其中，男11例，女9例，年齡26～79歲，平均年齡（58.00±15.32）歲。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象都簽署了知情同意書。

1.2EBUS-TBNA取材

1.2.1儀器 日本Olympus公司內鏡設備：包括常規纖支鏡、超聲內鏡、圖像處理系統及配套的穿刺針。

1.2.2術前準備 ①術前完善血常規、凝血功能、心電圖和胸部CT等檢查；②禁飲食6 h以上。

1.2.3EBUS-TBNA-TBNA標本的獲取 局麻下經鼻腔入鏡或全麻下經喉罩入鏡，將內鏡探頭置于擬穿刺部位，打開超聲圖像，確定穿刺病點，穿刺，穿入后可見病灶內穿刺針強回聲。抽吸獲取標本后固定，送常規病理檢查。在同一穿刺點再次穿刺，將標本置入EP管中，隨后放進-80℃冰箱保存。每個穿刺點穿刺3～6次。穿刺后禁飲食2 h，密切觀察有無并發癥發生。

1.3miRNA檢測

當患者肺內原發灶活檢經兩名高年資病理科醫生一致診斷為鱗癌、腺癌或小細胞肺癌，其EBUSTBNA標本見中低分化癌細胞但未能明確病理類型時，病理科對EBUS-TBNA標本進一步行免疫組化甲狀腺轉錄因子-1（thyroid transcription factor，TTF-1）和P63檢查，同時-80℃保存標本行miRNA檢查。

1.3.1主要試劑、儀器和耗材 TRIzol? Reagent（Life technologies）、RNase free吸頭和RNase free EP管（Axygen）、K2800核酸分析儀（北京凱奧）、Agarose（Biowest）、Nucleic Acid Stain 核酸染料（北京鼎國昌盛）、電泳儀（北京君意）、全自動凝膠成像分析系統（上海培清）、冷凍離心機（珠海黑馬）、Geneseed? First Strand cDNA Synthesis Kit和Geneseed? qPCR SYBR?Green Master Mix（Geneseed）、實時熒光定量PCR儀（ABI 7500）。

1.3.2RNA RNA提取 ①標本融化后充分混勻，取300.0μl EBUS-TBNA樣本，加入1.0 ml Trizol后，室溫靜置5 min，使其充分裂解；②按200.0μl氯仿/ml Trizol的比例加入氯仿，用手劇烈振蕩15 s，室溫放置15 min；③4℃，12 000 g離心15 min；④溶液分為3層，RNA溶解在水相中，把上層水相吸引出來，移至另一離心管中；⑤按1.0 ml 75%乙醇/ml Trizol的比例加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；⑥4℃ 7 500 g離心5 min，盡量棄上清；⑦室溫晾干5～10 min，加入40.0μl DEPC水溶解沉淀；⑧RNA質量和完整性檢測：測OD值定量RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA完整性。

1.3.3引物合成 廣州吉賽生物科技有限公司合成。

1.3.4 .3.4 逆轉錄反應 20.0 μl反應體系：2 ×RT Mix 5.0 μl，Geneseed? Enzyme Mix 1.0 μl，has-miR-21 RT引物0.5 μl，has-miR-205 RT引物0.5 μl，has-miR-375 RT引物0.5 μl，U6 RT引物0.5 μl，Total RNA 1 μg，加RNase free dd H2O至20.0 μl。反應條件：25℃ 5 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min。

1.3.5實時定量PCRPCR實驗 用SYBE-GREEN法。20.0μl反應體系：Geneseed? qPCR SYBR? Green Master Mix 10.0 μl，Forward primer（10 μmol/L）0.5 μl，Reverse primer（10 μmol/L）0.5μl，50x ROX Reference Dye 2 0.4 μl，模板DNA 2，加滅菌蒸餾水至20.0μl。反應程序設置：預變性95℃ 5 min，循環反應40個循環95℃ 10 s、60℃（采集信號）34 s，熔解曲線95℃15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

1.3.6實時定量PCRPCR數據處理 以U6為內參。根據2-△△Ct公式計算目標基因表達情況。△Ct=Ct目標miRNACtU6，△△Ct=肺癌組△Ct-對照組△Ct=肺癌組（Ct目標miRNACtU6）-對照組（Ct目標miRNA- CtU6）=X。則肺癌組樣本內miRNA的表達水平為對照組樣本內的2-X倍。

1.4統計學方法

使用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。所有計量資料均進行正態性檢驗，正態分布資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較，方差齊用LSD和SNK-q檢驗、方差不齊用Kruskal-Wallis檢驗。資料不符合正態分布時采用秩和檢驗。P ＜0.05表示差異有統計學意義。作受試者工作曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）來評價miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375診斷肺癌和肺癌病理分型的能力，分別計算曲線下面積（AUC）來評估其診斷效能，并確定臨界值及其相關的靈敏度、特異度。

2 結果

2.1miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375在肺癌組和對照組EBUS-TBNA標本的相對表達量

肺癌組EBUS-TBNA標本miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義（均P ＜0.01）。見表1。

2.2EBUS-TBNA標本檢測miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375對肺癌的診斷價值

作ROC曲線來評價EBUS-TBNA標本中miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的相對表達量對肺癌的診斷價值。miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.944（95%可信區間：0.877～1.000）、0.973（95%可信區間：0.936～1.000）和0.991（95%可信區間：0.975～1.000），AUC均在0.900以上，提示有較高的準確性。miRNA-21取1.635為診斷肺癌的臨界值時，其敏感度、特異度和準確度分別為82.86%、95.00%和77.86%；miRNA-205取1.475為診斷肺癌的臨界值時，其敏感度、特異度和準確度分別為94.25%、95.00%和89.29%；miRNA-375取4.505為診斷肺癌的臨界值時，其敏感度、特異度和準確度分別為100.00%、90.00%和90.00%。上述數據表明EBUSTBNA標本的miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375相對表達量對診斷肺癌有較高的診斷效能。

表1 miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的相對表達量

表1 miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的相對表達量

組別miRNA-21miRNA-205miRNA-375肺癌組（n =35）2.038±0.6322.203±0.68314.137±10.717對照組（n =20）1.103±0.3271.109±0.2792.245±1.558 t值7.128.486.45 P值0.0000.0000.000

2.3EBUS-TBNA標本的miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的表達水平對肺癌病理分型的價值

EBUS-TBNA標本miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375在肺鱗癌、腺癌和小細胞肺癌的相對表達量不全相同，差異有統計學意義（均P ＜0.01），見表2。進一步兩兩比較發現，miRNA-21在鱗癌患者EBUS-TBNA標本的表達水平明顯低于腺癌，差異有統計學意義（P ＜0.05）；miRNA-205在鱗癌患者EBUS-TBNA標本的表達水平明顯高于腺癌，差異有統計學意義（P ＜0.05）；miRNA-375在小細胞肺癌患者EBUS-TBNA標本的表達水平明顯高于鱗癌和腺癌，差異有統計學意義（均P ＜0.05）。

2.4非小細胞肺癌患者EBUS-TBNA標本檢測miRNA-21對肺腺癌的診斷價值，并與免疫組化指標TTF-1比較

作ROC曲線來評價miRNA-21診斷肺腺癌的價值，miRNA-21的AUC為0.854（95%可信區間：0.718～0.990）；取1.955為診斷臨界值時，以肺癌原發灶活檢的組織病理結果為金標準，miRNA-21診斷肺腺癌的Kappa值為0.582，一致性一般，與肺腺癌的TTF-1陽性表達（圖1）比較，其診斷腺癌的特異度同TTF-1，但敏感度低于TTF-1。見表3。

表2 肺癌EBUS-TBNA標本miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的相對表達量

表2 肺癌EBUS-TBNA標本miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的相對表達量

組別miRNA-21miRNA-205miRNA-375鱗狀細胞癌（n =12）1.552±0.198 2.905±0.622 12.932±6.379腺癌（n =20）2.286±0.670 1.788±0.336 10.430±4.795小細胞肺癌（n =3）2.330±0.684 2.393±0.462 43.673±7.460 F值12.6922.24-H值--46.75 P值0.0010.0000.000

2.5非小肺癌患者EBUS-TBNA標本檢測miRNA-205對肺鱗癌的診斷價值，并與免疫組化指標P63比較

作ROC曲線來評價miRNA-205診斷肺鱗癌的價值，miRNA-205的AUC為0.971（95%可信區間：0.920～1.000），取2.305為診鱗癌的臨界值時，以肺癌原發灶活檢的組織病理結果為金標準，miRNA-205診斷肺鱗癌的Kappa值為0.932，一致性較好，與肺鱗癌的P63陽性表達（圖2）比較，其診斷鱗癌的特異度和敏感度均高于P63。見表4。

圖1 TTF-1表達于肺腺癌的細胞核 （SP法，×400）

圖2 P63表達于肺鱗癌的細胞核 （SP法，×400）

表3 EBUS-TBNA標本檢測miRNA-21和TTF-1診斷肺腺癌的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和Youden指數

表4 EBUS-TBNA標本檢測miRNA-205和P63診斷肺鱗癌的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和Youden指數

3 討論

近些年來，隨著精準醫學的發展，對肺癌的準確分型要求越來越高。一方面肺癌的分子靶向治療要求更精確的組織學分類，如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）/受體酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene 1，receptor tyrosine kinase，ROS1）等基因活化主要發生在腺癌，程序性死亡受體-1（programmeddeath-1，PD-1）單抗Nivolumab僅僅在晚期鱗癌中獲批；另一方案培美曲塞和貝伐單抗等藥物僅在非鱗非小細胞肺癌中獲批。如果鱗癌患者使用貝伐單抗或培美曲賽治療可能出現嚴重甚至致死性的不良反應，而小細胞肺癌使用貝伐單抗作用不大。明確病理分型是肺癌個體化藥物治療的基礎。肺癌手術切除標本可以準確的病理分型和進行詳盡的分子生物學研究，但術后多年后復發的患者并不能用之前手術切除標本進行分析，因為轉移復發灶的生物學特點可能與原發灶不同；另外，約2/3的患者在進行肺癌診治時已是晚期，無法獲取手術切除的組織標本，多數能取到的就是纖支鏡活檢或細針穿刺標本。EBUSTBNA是一項常用的肺癌診斷和分型的細針穿刺技術，能夠使大部分肺癌得到準確的診斷［2］，但同時也有一部分無法分型或錯誤分型［5］，尤其是低分化癌、活檢小標本所含腫瘤細胞不多、缺乏組織結構或組織本身的有較大異質性時，準確分型的難度就更大［6-7］。免疫組化在一定程度上能提高肺癌分型的準確性，但免疫組化方法也有其不足［8-10］，其診斷和分型的能力有限。因此，有必要尋求一種新型的、更加準確的肺癌分型方法。近年來對miRNA的研究為解決之一難題提供了契機。

國外多項研究表明，檢測肺癌手術切除標本的miRNA可以成功的鑒別肺鱗癌和腺癌，其準確度達90.00%～100.00%［6，11-14］。GILAD等［11］研究451份肺癌及肺部良性病變標本的8種miRNAs（miRNA-106a、miRNA-125a、miRNA-129、miRNA-205、miRNA-21、miRNA-7、miRNA-375和miRNA-29b）發現，miRNA準確鑒別肺部良性腫瘤、小細胞肺癌、鱗狀細胞癌和腺癌的準確度達93.70%，即使是臨床上難以鑒別的細胞學標本通過檢測miRNAs也能準確的進行病理分型。PATNAIK等［6］研究發現，使用常規的組織學方法進行非小細胞肺癌的病理分型，有21.00%是無法分型或錯誤分型的，聯合檢測miRNA-205和miRNA-375可提高準確鑒別肺鱗腺癌率至96.00%。有研究人員使用PCR方法檢測肺癌組織和正常肺組織的石蠟包埋標本的miRNA-205和miRNA-375的表達水平發現，miRNA-205在鱗癌中的表達水平明顯上調，miRNA-375在小細胞肺癌中的表達水平明顯上調［12］。LEBANONY等［13］評價miRNA-205和miRNA-21的表達水平對鑒別肺鱗腺癌的意義，他們發現miRNA-205在鱗腺癌中的表達水平明顯升高，被認為是肺鱗癌的特異性生物標志物，其準確分型的敏感性為96.00%，特異性為90.00%，AUC為0.960。BISHOP等［14］旨在比較miRNA-205和miRNA-21的表達水平與非小細胞肺癌顯微鏡下病理結果聯合免疫組化結果的吻合率，發現結果100.00%吻合。目前多個研究證實了miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375有助于肺癌分型，其他miRNA是否有助于肺癌的分型尚需進一步研究驗證。因此，本研究選取了上述3種miRNAs進行研究，且是檢測EBUSTBNA標本而不是肺癌手術標本。本研究結果顯示：miRNA-375在小細胞肺癌EBUS-TBNA標本的表達水平明顯高于鱗癌和腺癌，提示miRNA-375可以鑒別小細胞肺癌和非小細胞肺癌；在非小細胞肺癌中，miRNA-21在腺癌EBUS-TBNA標本的表達水平明顯高于鱗癌，而miRNA-205在腺癌患者的EBUS-TBNA標本的表達水平明顯低于鱗癌，提示miRNA-21和miRNA-205具有鑒別肺鱗腺癌的能力。聯合檢測EBUS-TBNA標本的miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375，對肺癌病理分型有較高的價值。

目前免疫組化被認為是肺癌分型有效的補充手段，TTF-1是肺腺癌公認的免疫組化標志物，P63是肺鱗癌公認的標志物。將無明確腺癌或鱗癌形態特征，且不表達肺癌常見表面標志物的一類腫瘤定義為NSCC-NOS，此時，需要結合患者的影像學特征，排除肺轉移瘤的可能。這種形態學腫瘤，若其TTF-1表達陽性，則稱之為NSCC-NOS，傾向于腺癌；若P63表達陽性，則稱之為NSCC-NOS，傾向于鱗癌［3］。本研究對miRNA-21、miRNA-205鑒別肺鱗腺癌的效能和免疫組化指標TTF-1、P63相比較，發現miRNA-21對診斷腺癌的特異度同TTF-1、但敏感度略低于TTF-1，而miRNA-205對診斷鱗癌的敏感度和特異度均優于P63。

本研究還比較了35例肺癌患者和20例肺部良性病變患者的EBUS-TBNA標本的miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的表達情況，發現肺癌患者EBUS-TBNA標本的miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375的相對表達量明顯高于肺部良性病變者，它們的敏感度和特異度分別為82.86%和95.00%、94.25%和95.00%、100.00%和90.00%，表明它們對肺癌的診斷有較高的價值。與既往研究結果相符［15-16］。

本研究證明了EBUS-TBNA標本進行miRNA的檢測是可行的。EBUS-TBNA獲取標本的miRNA-21、miRNA-205和miRNA-375表達水平對肺癌的診斷和病理分型均有較大價值，尤其是對于無法獲取肺癌原發灶標本而僅能獲取EBUS-TBNA標本的患者或常規病理無法準確分型的中低分化肺癌患者，其應用價值更大，進一步提高EBUS-TBNA技術的臨床應用價值，對肺癌患者的個體化精準治療有一定的指導意義。但本研究樣本量小，尤其是小細胞肺癌僅3例，需進一步擴大樣本量驗證。

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（吳靜 編輯）

Classifi cation of lung cancer using three microRNAs in endobronchial ultrasound-guided tranbronchial needle aspiration samples

Xi Li， Jing-song Lin， Gui-yang Chen， Ming-zhen Chen， Yan-shan Lu， Fu Rong
（Department of Respiratory Medicine， the First People’s Hospital， Shunde， Guangdong 528300， China）

Objective To explore the signifi cance of three microRNAs expression in endobronchial ultrasoundguided transbronchial needle aspiration （EBUS-TBNA） samples for classification of lung cancer. Methods With qRT-PCR， the expression of miRNA-21， miRNA-205 and miRNA-375 were detected in EBUS-TBNA samples of 35 lung cancer patients. A group of 20 patients with benign mediastinal lymphadenopathy served as a control. The value of miRNA expressions for classifi cation of lung cancer was evaluated. Results The expressions of miRNA-21，miRNA-205 and miRNA-375 were significantly higher in EBUS-TBNA samples of lung cancer patients than those in control samples. The expressions of miRNA-21 were signifi cantly higher in EBUS-TBNA samples of lung adenocarcinoma than those in lung squamous cell carcinoma. The expressions of miRNA-205 were significantly higher in EBUS-TBNA samples of lung squamous cell carcinoma than those in lung adenocarcinoma. The expressions of miRNA-375 were signifi cantly higher in EBUS-TBNA samples of small cell lung cancer than those in non- smallcell lung cancer. ROC curve analysis showed that taking 1.945 as a cutoff value， the sensitivity and specifi city for miRNA-21 expression in EBUS-TBNA samples of lung adenocarcinoma were 65.00% and 100.00%； taking 2.305 as a cutoff value， the sensitivity and specifi city for miRNA-205 expression in EBUS-TBNA samples of lung squamous cell carcinoma were 91.67% and 100.00%. Conclusion EBUS-TBNA samples were suitable for detection of miRNA. Detecting miRNA-21， miRNA-205 and miRNA-375 expression could help diagnosis and classifi cation of lung cancer.

endobronchial ultrasound； transbronchial needle aspiration； microRNA； lung cancer； diagnosis；sub-classifi cation

R734.2

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2016.10.014

1007-1989（2016）10-0060-06

2016-05-04

榮福，E-mail：rongfu828@sina.com；Tel：13702349838