兔病毒性出血癥病毒分離和鑒定

張穎 王金良

（山東省濱州市畜牧獸醫研究院 256600）

兔病毒性出血癥病毒分離和鑒定

張穎 王金良

（山東省濱州市畜牧獸醫研究院 256600）

從疑似感染兔病毒性出血癥病毒的病兔體內分離到1株病毒，病兔表現體溫升高、呼吸困難、全身實質臟器出血等典型病變。取病兔肝臟做血凝和血凝抑制試驗，分離毒株可以凝集1.0%人 “O”型紅細胞，可以被兔病毒性出血癥病毒陽性血清中和，對家兔的LD50為10-6.75/ml，是一株對家兔具有高致病力的強毒株，對分離毒株進行RT-PCR檢測為陽性，說明該病兔感染了兔病毒性出血癥病毒，本病毒的成功分離和鑒定為發病兔場找到了致病原，為兔瘟疾病的診斷和防制提供了參考。

兔病毒性出血癥病毒；分離；鑒定

兔病毒性出血癥 （Rabbit viral hemorrhagic disease，RHD）是一種急性高度接觸性傳染病，病原為兔病毒性出血癥病毒（Rabbit viral hemorrhagic disease viruses，RHDV），各品種和不同性別的兔均易感，該病主要表現為呼吸系統出血、肝壞死、實質臟器水腫、淤血及出血性變化[1，2]。該病于1984年在我國江蘇省江陰縣首次暴發[3]，隨后廣泛流行于世界各地[4.5]，目前該病呈世界范圍內流行，每年都給全球養兔業帶來嚴重的經濟損失，也是目前危害我國養兔業健康發展的頭號殺手[6]。2016年3月，山東省濰坊市某兔場發生了一起以體溫升高、食欲下降、鼻孔流血、氣管出血、肝臟出血為主要特征的疫病，為對兔場此次疫病進行確診，獲得病原體豐富本單位生物資源及為相應的疫苗研制奠定基礎，筆者對該兔場進行了兔病毒性出血癥病毒的分離和鑒定，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 臨床癥狀

發病兔表現體溫升高、精神沉郁、呼吸困難、呼吸系統出血、肝壞死并出血等典型癥狀，采集病兔的肝臟作為接種病料樣品。

1.2 試劑、血清、紅細胞、試驗動物

Taq酶、DL 2000 Mrker、膠回收試劑盒購自生工生物工程 （上海）股份有限公司；兔病毒性出血癥病毒陽性血清購自中國獸醫藥品監察所；人“O”型紅細胞由濱州市中心血站饋贈；新西蘭白兔購自青島康大兔業發展有限公司。

1.3 病料的處理

采集病兔的肝臟用滅菌生理鹽水適當稀釋，制成10%乳劑，反復凍融3次，12000r/min離心10min，取上清液經0.22μm濾膜過濾，-20℃保存備用。

1.4 病毒分離

將處理好的病料樣品頸部皮下注射體重為2.0kg健康新西蘭白兔5只，每日觀察試驗兔的臨床癥狀，兔死亡后迅速剖檢并觀察病理變化，無菌采集死亡兔的病變組織樣品按上述方法再傳2代。

1.5 血凝試驗

采用微量法測定分離毒株對1.0%人 “O型”紅細胞的凝集性。

1.6 中和試驗

將分離毒株與等量抗兔病毒性出血癥病毒陽性血清混勻，37℃中和反應1h后做血凝試驗。

1.7 毒力試驗

用滅菌生理鹽水將分離株病毒依次作10倍系列稀釋，取每個稀釋度分別頸部皮下注射健康新西蘭白兔5只，1.0ml/只，計算分離毒株對家兔的LD50。

1.8 RT-PCR鑒定

根據參考文獻[7]設計兔病毒性出血癥病毒特異性檢測引物 （P1:5'-CGTGC TTCAGTTTTGGTA-3'；P2:5'-ATGAGTGCTGACGAGTAG-3'），引 物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成。按照參考文獻[7]中兔病毒性出血癥病毒RT-PCR反應條件進行分離毒株的PCR檢測，對PCR擴增產物送生工生物工程 （上海）股份有限公司測序鑒定。

2 結果與分析

2.1 病毒分離結果

組織病料樣品連續傳代3次均對家兔具有高致病性，攻毒家兔均100%死亡，死亡兔表現出鼻孔出血、尸體僵直等臨床癥狀，剖檢觀察可見氣管出血，呈現 “紅氣管”特征，肝臟、脾臟、腎臟、心臟等實質臟器出血、瘀血、腫大。無菌收集第3代分離株病毒，命名為WF株，-20℃保存備用。

2.2 血凝性的測定結果

微量法測定WF株病毒對人 “O”型紅細胞的凝集效價為1：1024。

2.3 中和試驗結果

WF株病毒與等量抗兔病毒性出血癥病毒陽性血清37℃中和反應1h后對人 “O”型紅細胞無凝集效價，WF株病毒的血凝作用被抑制，證實分離毒株為兔病毒性出血癥病毒。

2.4 毒力試驗結果

按Reed-Muench法測定WF株病毒對家兔的LD50為10-6.75/ml，分離毒株具有較強的毒力。

2.5 PCR鑒定結果

按照參照文獻[7]的方法，WF株病毒可擴增出586bp目的條帶 （見附圖），與預期大小相一致。PCR擴增產物送生工生物工程 （上海）股份有限公司測序鑒定為兔病毒性出血癥病毒VP60基因特異性序列，從分子水平鑒定為該病兔發生了兔病毒性出血癥病毒感染。

3 討論

本研究從疑似感染兔病毒性出血癥病毒的病兔體內分離到1株兔病毒性出血癥病毒。該病毒與1.0%人 “O”型紅細胞做微量血凝試驗陽性，利用兔病毒性出血癥病毒標準陽性血清可以中和分離的兔病毒性出血癥病毒。病毒分離是疾病診斷的可靠方法，為了對病毒分離結果進行驗證，本研究還進行了分子生物學PCR檢測，通過對PCR擴增產物測序鑒定說明，分離毒為兔病毒性出血癥病毒的特異序列，為病兔發生兔病毒性出血癥病毒感染提供有力的診斷依據。通過對兔病毒性出血癥病毒的分離鑒定，為兔病毒性出血癥病毒相關疾病的診斷提供參考，也為本實驗室研制安全、高效的RHD疫苗奠定了基礎。

附圖 PCR擴增結果

兔場發生兔病毒性出血癥病毒感染后，對發病兔采取緊急隔離飼養，飼養場進行嚴格消毒，糞、墊草和污物集中銷毀，兔群進行兔病毒性出血癥疫苗的緊急免疫接種，對器具、水槽和飼料槽用消毒藥浸泡、清洗和消毒。本病的發生與飼養場衛生環境不良有很大關系，飼養密度過大，通風不良，兔舍陰暗潮濕，兔病毒性出血癥疫苗免疫接種不及時等有很大關系，通過對本病的診治，提高了養殖場對本病的重視，改善了兔場的飼養環境，兔病毒性出血癥的發病情況得到有效控制。

[1]譚永貴,繆秋紅,吳巧梅,等.新型兔出血癥病毒研究進展[J].中國動物傳染病學報,2016,24(1):80-86.

[2]汪亮.兔病毒性出血癥的流行、診斷及防控[J].畜牧獸醫科技信息,2015(10):12-13.

[3] 劉勝江,薛華平,蒲伯清,等.兔的一種新病毒病-兔病毒性出血癥[J].畜牧與獸醫,1984（6):253-255.

[4]Mitro S,Krauss H.Rabbit hemorrhagic disease:a review withspecialreference to its epizootiology[J].Eur J Epldemio,1993,9(1):70-78.

[5]Nowotny N,Ros Bascunana C,Ballagi-Pordany A,et al.Phylo-geneifc analysis of rabbithaemorrhagic disease and European brownhare Syndrome viruses by comparison of sequences fromthe capsidprotein gene[J].Arch Virol,1997,142(4):657-673.

[6]曹德祥,白玫.兔病毒性出血癥的流行癥狀以及防控措施[J].山東畜牧獸醫,2015(1):49.

[7]程漢,曹軍平,包祥嘉.兔出血癥病毒RT-PCR檢測方法的建立及臨床應用[J].江蘇農業科學,2013,41(4):191-193.

張穎 （1975.6-)，女，助理研究員，研究方向：生物制劑。