棗莊地區(qū)高產(chǎn)奶牛鮮胚移植技術(shù)研究

劉兵 （山東省棗莊市畜牧獸醫(yī)局 277800）

棗莊地區(qū)高產(chǎn)奶牛鮮胚移植技術(shù)研究

劉兵 （山東省棗莊市畜牧獸醫(yī)局 277800）

為了解決棗莊地區(qū)奶牛存欄量少，引進(jìn)高產(chǎn)奶牛價(jià)格昂貴，改良周期太長(zhǎng)的問題，進(jìn)行了以引進(jìn)優(yōu)良高產(chǎn)奶牛種母牛，采用人工授精、采集鮮胚移植入低產(chǎn)奶牛的子宮內(nèi)讓其正常發(fā)育、分娩，直接獲取高產(chǎn)奶牛的研究。

高產(chǎn)奶牛；胚胎移植；飼養(yǎng)管理

1 材料和方法

首先從上海光明乳業(yè)引進(jìn)良種奶牛，同時(shí)購置鮮胚移植所需的設(shè)備和藥品試劑等；其次按選配標(biāo)準(zhǔn)選擇受體牛；三是采集優(yōu)良胚胎，采用同期發(fā)情技術(shù)移植進(jìn)受體牛子宮內(nèi)；四是加強(qiáng)移植后和產(chǎn)后管理，保證成功率。此項(xiàng)目與山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、棗莊市畜牧局、臺(tái)兒莊區(qū)畜牧水產(chǎn)局、山東祥和乳業(yè)有限責(zé)任公司等共同研究。

2 研究?jī)?nèi)容

2.1 供體、受體奶牛的選擇及飼養(yǎng)管理

2.1.1 供體母牛的選擇

2014年5～6月在上海光明乳業(yè)奶牛場(chǎng)選擇高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)母奶牛5頭，作為本次試驗(yàn)用的供體母牛。選擇標(biāo)準(zhǔn)：①供體牛品種優(yōu)良，具有較高的生產(chǎn)性能；②體格健壯，性情溫和，無遺傳性疾病，繁殖機(jī)能正常，年齡在13月齡到8歲為宜；③產(chǎn)犢記錄清楚，無流產(chǎn)病史，產(chǎn)后60d以上，有兩次以上正常發(fā)情記錄；④生殖器官正常，無產(chǎn)科性疾病，長(zhǎng)期空懷的母牛不做供體；⑤重復(fù)超數(shù)排卵的供體牛每次處理需間隔60d左右，連續(xù)處理4～5次后進(jìn)行配種，使之妊娠，產(chǎn)犢后再實(shí)施超排，凡2次超排反應(yīng)差的母牛不宜再用。

2.1.2 受體牛的選擇

本地區(qū)挑選奶牛300頭作備用受體牛。選擇標(biāo)準(zhǔn)：①選擇低產(chǎn)奶牛為受體；②受體牛須有兩個(gè)以上正常情期，生殖道分泌物清亮，牽縷性強(qiáng)，無灰白或灰黃絮狀物存在；③無繁殖機(jī)能疾病和傳染病；④性情溫順，體高110cm以上，毛色光亮，體格健壯，膘情在7成以上；⑤經(jīng)產(chǎn)牛年齡為2～6歲、產(chǎn)犢后90d以上，青年牛達(dá)到16月齡以上、體重達(dá)到成年母牛體重的75%；⑥產(chǎn)犢性能和泌乳性能良好，無流產(chǎn)史，上胎無難產(chǎn)、助產(chǎn)情況；⑦人工授精兩次或鮮胚移植兩次不孕者不挑選；⑧直腸檢查，檢查卵巢、子宮無粘連，游離性好，子宮位置、體積、彈性、質(zhì)地、收縮反應(yīng)正常，選擇卵巢上具有功能性黃體。

2.1.3 供體、受體牛的飼養(yǎng)管理

①保持牛群飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生，干燥，棚舍溫度適宜，飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，避免應(yīng)激反應(yīng)；②制定合理的供體牛日糧配方，保證正常的營(yíng)養(yǎng)狀況和營(yíng)養(yǎng)平衡，受體牛在移植前6～8周開始補(bǔ)飼，補(bǔ)充微量元素和維生素；③滿足牛清潔飲水的需要；④經(jīng)產(chǎn)牛做供體產(chǎn)后至超排沖胚和育成牛做供體超排沖胚前3個(gè)月時(shí)，加強(qiáng)飼養(yǎng)，平均日增重0.30～0.40kg/d，使超排時(shí)總增重達(dá)個(gè)體體重的5%以上。

2.2 胚胎移植

對(duì)5頭供體奶牛在發(fā)情配種后第7天和第8天沖胚。

2.2.1 非手術(shù)沖卵技術(shù)操作步驟

①保定供體牛，呈頭高尾低狀態(tài)，在第一、二尾椎結(jié)合處用2%利多卡因 （5～10ml）作尾椎硬膜外麻醉；②排糞及清潔外陰部。用清潔溫水清洗后用消毒毛巾擦干凈；③采用直腸把握法。用子宮頸擴(kuò)張棒擴(kuò)張子宮頸，插入黏液去除棒，抽出子宮頸內(nèi)黏液。將沖卵管插入須沖洗的子宮角，到達(dá)子宮角彎曲部位時(shí)將鋼芯退出約3cm，繼續(xù)向前推進(jìn)沖卵管，當(dāng)鋼芯再次到達(dá)子宮角彎曲部位時(shí)，再將鋼芯退出少部分并將沖卵管向前推進(jìn)，如此反復(fù)，直到?jīng)_卵管前端到達(dá)子宮角深部。從沖卵管沖氣孔用注射器注入約9～18ml空氣使氣球膨脹，關(guān)閉進(jìn)氣孔后，將鋼芯取出開始沖胚；④用注射器從沖卵管口將沖卵液推入子宮角，用直腸中的手將子宮角抬高，用集卵漏斗接入集卵皿內(nèi)。一般反復(fù)沖7～8次，沖洗完后推兩次空氣進(jìn)入子宮角，幫助液體排空；⑤沖胚時(shí)按每頭牛用一個(gè)容器裝回收液，做好標(biāo)記。

2.2.2 術(shù)后處理

沖卵結(jié)束后，將氣球內(nèi)的空氣放掉，把沖卵管抽回至子宮體，直接從沖卵管灌注青霉素、鏈霉素和氯前列烯醇4ml，再拔出沖卵管。

2.2.3 檢胚

①檢胚前的準(zhǔn)備；檢胚前試驗(yàn)室及各種器具要事先作好消毒工作，室溫要保持在25℃；②胚胎回收采取兩種方法。過慮法回收和沉淀法回收；③找胚。用體視顯微鏡放大6×1.5倍進(jìn)行找胚，找到的胚胎用自制的玻璃微吸管把胚胎取出，檢出的胚胎放入裝有培養(yǎng)液的平皿中。

2.2.4 胚胎的質(zhì)量鑒定和分級(jí)

鑒定一般在放大60～200倍體視顯微鏡下進(jìn)行。①鑒定依據(jù)。一是未受精卵一沒有分裂球及胞團(tuán)的卵子；二是桑椹胚一發(fā)情后5～6d沖出的卵，只觀察到球狀的細(xì)胞團(tuán)，分不清分裂球，占據(jù)透明帶內(nèi)腔的大部分；三是致密桑椹胚一發(fā)情后第6～7天回收的卵，細(xì)胞團(tuán)變小，占透明帶內(nèi)腔的60～70%；四是早期囊胚一發(fā)情后第7～8天沖出的卵，細(xì)胞的一部分出現(xiàn)發(fā)亮的胚泡腔；細(xì)胞團(tuán)占透明內(nèi)腔的70～80%，難以分清內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層；五是囊胚一發(fā)情后第7～8天回收的卵子內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層界線清晰，胚泡腔明顯，細(xì)胞充滿透明帶內(nèi)腔；六是擴(kuò)張囊胚一發(fā)情后第8～9天回收的卵子，胚泡腔明顯擴(kuò)大，體積增大到原來的1.2～1.5倍，與透明帶之間無空隙，透明帶變薄，相當(dāng)于正常厚度的1/3；②胚胎的分級(jí)。根據(jù)卵子分裂與否，形態(tài)色調(diào)、分裂球大小、均勻度、細(xì)胞的密度、透明帶以及變性情況將胚胎分為A、B、C、D4個(gè)等級(jí)。A、B、C級(jí)胚胎為可用胚胎，D級(jí)胚胎為不可用胚胎。通過5次供體牛超數(shù)排卵沖出的胚胎，鑒定后A、B、C3級(jí)胚胎占87.29%，共254枚，D級(jí)胚胎37枚。

2.3 鮮胚移植

供、受體牛經(jīng)過同期發(fā)情處理，從供體牛獲得的胚胎立即移植到受體牛的子宮內(nèi)。

2.3.1 胚胎沖洗

在移植前對(duì)胚胎進(jìn)行沖洗，方法是在一個(gè)培養(yǎng)皿中，分別滴10～12滴培養(yǎng)液，每滴0.1ml左右，用玻璃微吸管吸入培養(yǎng)液，從培養(yǎng)液中取出胚胎放入第1滴培養(yǎng)液中，如此反復(fù)直到最后1滴沖洗完畢。

2.3.2 裝細(xì)管及輸胚器 （槍）

用0.25ml的塑料細(xì)管，采用7段裝胚法，用微型注射器吸入。輸胚器的安裝基本與細(xì)管精液輸精槍相同，裝好后要注意保溫和避免污染，并要盡快輸入受體牛子宮。

2.3.3 合理搭配受體和胚胎

一般處于發(fā)情第6天的受體牛選用致密桑椹胚移植；處于發(fā)情第7天的受體牛選用早期囊胚移植；處于發(fā)情第8天的受體牛選用囊胚或擴(kuò)張囊胚移植。

2.3.4 輸胚

受體牛采用備選的300頭低產(chǎn)奶牛，采取同期發(fā)情后共有278頭奶牛經(jīng)同期發(fā)情鑒定后，符合受體牛標(biāo)準(zhǔn)。輸胚前確定受體牛處于發(fā)情周期的第6～8天，通過直腸檢查卵巢上是否有明顯的黃體存在，只有明確了黃體的存在并發(fā)育正常，才能進(jìn)行輸胚，而且胚胎必須輸在有黃體一側(cè)的子宮角深處。操作方法：先將塑料保護(hù)外套插入陰道，再插入輸胚器。盡量減少對(duì)子宮的刺激，避免子宮受傷，從插入輸胚器到開始輸胚的時(shí)間越短越好，一般最好在3min內(nèi)完成操作。

2.4 妊娠診斷和飼養(yǎng)管理

2.4.1 妊娠診斷

移植后的受體牛分群飼養(yǎng)，加強(qiáng)管理，觀察并做好受體牛的發(fā)情記錄。移植70～90d后進(jìn)行妊娠診斷。受體牛經(jīng)移植妊娠成功158頭，移植成功率達(dá)62.40%。

2.4.2 飼養(yǎng)管理

對(duì)鮮胚移植后妊娠的受體奶牛加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，避免應(yīng)激反應(yīng)，妊娠受體在產(chǎn)前3個(gè)月補(bǔ)充足量的維生素、微量元素，鈣磷比例控制在1～1.5：1。產(chǎn)前45d，適當(dāng)限制能量攝入，既要保證胎兒的正常發(fā)育，又要避免難產(chǎn)。避免打斗、追趕，不要抽打受體牛以免引起流產(chǎn)，加強(qiáng)防疫消毒，保持圈舍清潔衛(wèi)生。

2.5 分娩及產(chǎn)后管理

（1）對(duì)162頭受體妊娠母牛的分娩情況統(tǒng)計(jì)見附表。

附表 受體妊娠母牛分娩情況統(tǒng)計(jì)表

手術(shù)分娩的原因主要是選擇小規(guī)模飼養(yǎng)戶的受體牛，懷孕后期飼養(yǎng)管理沒有跟上，導(dǎo)致受體牛膘情較差，個(gè)別胎兒體位不正造成的。流產(chǎn)受體牛主要是因?yàn)閼言泻笃诨疾。委煵患皶r(shí)造成的。

（2）哺乳母牛的飼養(yǎng)管理。①對(duì)哺乳期的母牛加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，補(bǔ)充足量的微量元素和維生素，以滿足犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育，采取專人專管；②優(yōu)良犢牛一定要讓其有充分的母乳來滿足犢牛的需要，否則會(huì)影響犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育。

3 結(jié)論

通過高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)良種供體奶牛的引進(jìn)，開展超數(shù)排卵、同期發(fā)情、鮮胚移植、妊娠、分娩管理等試驗(yàn)。取得了較好的研究目標(biāo)。供體奶牛超數(shù)排卵后沖胚有效胚胎平均達(dá)10.08枚/頭/次，鮮胚移植成功率達(dá)62.40%，經(jīng)鮮胚移植產(chǎn)后的母牛1個(gè)產(chǎn)奶周期平均產(chǎn)奶量達(dá)10.8t，乳脂率達(dá)到3.6%，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益明顯增加，提高了農(nóng)民收入，為加快奶業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有中重要的推動(dòng)作用。