Vero細胞致腫瘤原性的研究

李冰潔

【摘要】 目的：通過對生產疫苗所用的細胞系進行的致腫瘤原性實驗，確定160代以內的Vero細胞可安全用于生產。方法：用Vero細胞和Hela細胞接種裸鼠，觀察腫瘤的發生情況。結果：Vero細胞實驗組裸鼠注射部位、肺部組織、肝臟組織均未見腫瘤組織發生；Hela細胞對照組的10只裸鼠全部有腫塊形成，致癌致瘤率為10/10（100%）。結論：Vero細胞系非致瘤性細胞系，符合我國對疫苗生產所用細胞的要求，其在160代以內可安全用于疫苗生產。

【關鍵詞】 Vero細胞； Hela細胞； 腫瘤原性； 研究

中圖分類號 R73 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2016）28-0157-02

作為生物制品研究與生產的重要原材料，傳代細胞系的株系特征，特別是其致腫瘤性，不僅直接影響到疫苗的質量，而且關系到人畜的健康與安全，因此一直被生物制品研究與生產部門所重視。生產疫苗所用細胞系應無外源因子污染，符合細胞遺傳學要求，尤其應在生產所使用的細胞代次內無致腫瘤性，這才能符合我國對疫苗生產所用細胞的要求。筆者在建立傳代Vero細胞種子庫與工作庫基礎上，對研制生產疫苗所用的Vero細胞系160代進行了致腫瘤原性實驗，以確定160代以內的Vero細胞可安全用于生產。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株：非洲綠猴腎Vero細胞，160代（沈陽安迪生物高科技公司）；人宮頸癌Hela細胞S-3株，13代（中國藥品生物制品檢定所細胞室）；（2）裸鼠：Balb/C無胸腺雌性裸鼠20只，約4周齡（中國藥品生物制品檢定所動物中心）。

1.2 方法

1.2.1 細胞制備 Vero細胞160代，250 ml細胞瓶，Hela細胞

13代4瓶，用胰酶消化，用無牛血清的Eagles MEM吹下、50 ml離心管1000 r/min，離心10 min，棄上清，加35 ml PBS重懸細胞沉淀，1000 r/min，離心10 min，棄上清，細胞沉淀用滅菌PBS洗1次，用1.5 ml PBS再洗1次，用1.5 ml PBS重懸細胞，取

0.1 ml，100倍稀釋，細胞計數，再將細胞濃度調到1.0×108/ml，Hela細胞為1.5 ml，Vero細胞為1.5 ml。

1.2.2 實驗方法 分為對照組和實驗組，對照組每只裸鼠頸部皮下注射0.1 ml Hela細胞，實驗組每只裸鼠頸下皮下注射0.1 ml Vero細胞，細胞濃度均為1.0×108/ml，各注射10只；每周觀察記錄1次裸鼠狀態、體重及注射部位變化，觀察30 d，而后將裸鼠處死，解剖，用10%中性緩沖福爾馬林固定裸鼠肺、肝、頸部接種部位組織，石蠟包埋切片，常規蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察[1-2]。

2 結果

2.1 一般狀態

2.1.1 實驗進行7 d時 實驗組裸鼠中有3只注射部位變紅，對照組裸鼠注射部位均出現直徑0.4～0.6 cm的結節。

2.1.2 實驗進行14 d時 實驗組裸鼠均正常并有體重增加，對照組裸鼠注射部位均出現直徑1.0～1.5 cm的結節，有2只結節中央有0.3～0.5 cm的潰瘍發生。

2.1.3 實驗進行21 d時 實驗組裸鼠均正常并有體重增加，對照組裸鼠注射部位均出現直徑1.0～2.0 cm的結節，其中2只裸鼠結節中央有0.5～0.8 cm的潰瘍發生，2只裸鼠死亡。

2.1.4 實驗進行30 d時 實驗組裸鼠均正常并有體重增加，對照組裸鼠注射部位均出現1.0～2.0 cm的結節，有2只結節中央有0.5～1.0 cm的潰瘍發生。

2.2 病理變化

通過顯微鏡病理切片檢查，實驗組（注射Vero細胞）的10只裸鼠注射部位未見異常、狀態良好、體重有增加，皮下組織、肺部組織、肝臟組織的病理切片均未見腫瘤組織發生；對照組（注射Hela細胞）剩余的8只裸鼠注射部位均見腫瘤發生，肺部組織、肝臟組織均未見腫瘤組織發生（見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6）。

圖1 對照組頸部腫物的病理切片 圖2 實驗組接種部位皮下組織病理

切片

注：圖1，Hela細胞接種裸鼠1個月頸部腫物的病理切片，未見腫瘤組織。圖2，Vero細胞接種裸鼠1個月接種部位皮下組織病理切片，未見腫瘤組織

圖3 對照組肝臟組織病理切片 圖4 實驗組肝臟組織病理切片

注：圖3，Hela細胞接種裸鼠1個月肝臟組織病理切片，未見腫瘤組織。圖4，Vero細胞接種裸鼠1個月肝臟組織病理切片，未見腫瘤組織

圖5 對照組肺部組織病理切片 圖6 實驗組肺部組織病理切片

注：圖5，Hela細胞接種裸鼠1個月肺部組織病理切片，未見腫瘤組織。圖6，Vero細胞接種裸鼠1個月肺部組織病理切片，未見腫瘤組織

3 討論

裸鼠先天性胸腺缺失，胸腺依賴性免疫功能缺乏，T或B淋巴細胞功能完全缺乏，異種移植時不產生排斥反應，所以國內外許多學者多選用裸鼠作為異種動物組織、細胞的移植和人類腫瘤異種動物組織、細胞的移植和人類腫瘤異種移植的首選對象。

實驗結果顯示，Vero細胞實驗組的10只裸鼠注射部位肺、肝均未見腫瘤性病變，致癌致瘤率為零；Hela細胞對照組的10只裸鼠全部有腫塊形成，致癌致瘤率為10/10（100%）。Hela細胞對照組的裸鼠在注射部位均有直徑1～2 cm大小的腫瘤發生。腫瘤中央有0.5～1.0 cm的潰瘍發生，解剖內臟，肺無明顯肉眼病變，肝臟有肉眼可見病變發生，肝腫大，表面有呈針尖大小多凸起病變發生，但除注射部位有惡性腫瘤發生外，肺及肝組織未見腫瘤性病變。本次實驗結果表明，Vero細胞系非致瘤性細胞系，符合我國對疫苗生產所用細胞的要求，其在160代以內可安全用于疫苗生產。所以，在采用Vero細胞進行疫苗生產過程中，要保障產品的安全性[3]，很有必要建立一個經過檢定的、低代次的細胞種子庫，并且在可能的情況下，對更高代次的Vero細胞進行檢定，以確保細胞種子庫的安全性及生產的需要。

近年來，Vero細胞作為連續細胞系在我國越來越多地用于病毒性疫苗的生產[4]，檢測方法也在不斷更新中[5]，并且在發達國家病毒疫苗生產的主要工藝技術是Vero細胞的微載體固定化培養，這也是目前我國致力于建立和完善的病毒疫苗生產技術[6]。隨著對疫苗質量和安全性要求的不斷提高，用無血清培養基取代含血清培養基Vero細胞已成為病毒疫苗生產的一個重要發展趨勢[7]，但商業化的Vero細胞無血清培養基還存在諸如培養基大多以液體的形式提供，價格昂貴等問題[8]，這在很大程度上限制了Vero細胞無血清培養基在病毒疫苗生產中的實際應用[9]。因此，用傳統的方法，開發更高代次的Vero細胞系仍是今后需要努力的方向。

參考文獻

[1]中華人民共和國衛生部.中國生物制品規程[M].北京：中國人口出版社，1995：121.

[2]施新.醫用實驗動物學[M].西安：陜西科學技術出版社，1989.

[3]洪小栩，李琦涵.加強疫苗生產用Vero細胞控制的思考[J].中國藥品標準，2012，13（5）：323-326.

[4]吳浩非飛，楊曉明.Vero細胞作為基質的病毒性疫苗研制進展[J].微生物學與免疫學進展，2011，3（39）：56-63.

[5]李愛靈，王紅燕，張月蘭，等.Vero細胞傳代過程中致瘤性的檢測[J].中華微生物學和免疫學雜志，2011，31（5）：456-461.

[6] Bluml G.Microcarrier cell culture technology[M].Methods Biotechnol，2007，24：149-178.

[7] Merten O W.Safety for vaccines[J].Cytotechnology，2000，34（3）：181-183.

[8] Ulmer J B，Valley U，Rappuoli R.Vaccine manufactueing：challenges and solutions[J].Nat Biotechnol，2006，24（11）：1377-1383.

[9]劉紅，陳天，李世崇，等.Vero細胞微載體培養的化學成分明確無血清培養基的設計[J].現代生物醫學進展，2013，13（32）：6210-6239.

（收稿日期：2016-06-22）