極細鏈格孢菌HZ-1對闊葉雜草的致病性及對作物的安全性評價

朱海霞，馬永強，程 亮，郭青云

(青海省農林科學院，農業部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016)

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極細鏈格孢菌HZ-1對闊葉雜草的致病性及對作物的安全性評價

朱海霞，馬永強，程 亮，郭青云*

(青海省農林科學院，農業部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海省農業有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016)

采用形態學結合分子鑒定的方法，對生防潛力菌株HZ-1進行分類學鑒定，通過菌株發酵液致病性測定，評價該菌株對5種闊葉雜草的除草活性，采用盆栽生測法評價其對青海省主栽作物的安全性。結果表明，HZ-1為極細鏈格孢菌(Alternariatenuissima)，菌株發酵液對豬秧秧(Galiumaparine)、刺兒菜[Cephalanoplossetosum(Willd.) Kitam]、藜(Chenopodiumalbum)、冬葵(Malvacrispa)、酸模葉蓼(PolygonumlapathifoliumL.)表現出不同程度的致病作用，尤其對豬秧秧、藜致病效果最為突出。安全性評價結果顯示，該菌株除對春油菜有輕微影響外，對春小麥、蠶豆、豌豆和青稞4種作物相對安全。綜上，HZ-1可作為防除豬殃殃、藜等闊葉雜草生物除草劑的候選菌株。

極細鏈格孢菌；闊葉雜草；致病性；作物安全性

農田雜草直接為害農業生產，影響農作物的產量和品質，是嚴重制約農業生產的主要因素之一[1]。青海省農田雜草達182種，分屬35個科，其中，引發為害的有91種，嚴重為害的有44種。田間發生頻率較高的雜草有17種，包括以野燕麥為主的禾本科雜草和以藜、冬葵、大刺兒菜、豬秧秧為典型代表的闊葉雜草。農田雜草泛濫已成為制約青海農業生產以及實現農業可持續發展的嚴重障礙[2-3]。

利用微生物資源防除雜草是目前生物除草研究的熱點，該方法具有對作物影響小、環境負效應少、安全性高等優點[4-6]，符合可持續農業的要求，已受到世界各國的高度重視。青藏高原具備獨特的氣候環境，孕育著獨特的微生物群落，很多極具發展前景的微生物資源尚待發掘。自2009年起，研究團隊對青海常見的農田雜草病原真菌資源進行調查、分離，從百余株雜草病原菌中篩選出了一些對雜草具有不同致病效果的生防菌。本研究以其中的一種潛力菌——極細鏈格孢(Alternariatenuissima)HZ-1菌株作為研究對象，對其進行形態及分子鑒定，研究其除草活性與生防安全性，為具有生防潛力的微生源除草劑開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株分離與純化

參照方中達[7]有關病原真菌的分離方法，按組織分離法對采集的雜草病樣進行分離純化，斜面培養后4 ℃冰箱保存。

1.2 菌株形態鑒定

將菌株HZ-1置于PDA平板培養基上進行培養，定期觀察菌落生長速度、菌落形態及色澤變化，光學顯微鏡下觀察其菌絲、孢子形態。結合《真菌鑒定手冊》進行初步鑒定。

1.3 菌株分子鑒定

參照王彥芹等[8]方法提取菌株DNA。選用擴增基因組DNA的ITS區的通用引物，分別為：ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5，5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR擴增反應體系如下：4 μL dNTP mixture，ITS4和ITS5各1.0 μL，6.0 μL的10×Taq reaction buffer，1.0 μLTaqDNA polymerase，模板DNA為2 μL，35.0 μL無菌去離子水。PCR循環設置如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共設35個循環。收集PCR產物進行測序，測序結果用chromas.exe軟件進行序列修正，從NCBI Blast檢索與目標序列同源性高的DNA序列，與本試驗所測序列分別進行菌株種內比對。利用MEGA 5.0軟件近鄰歸群法構建系統發育樹。

1.4 生防菌株HZ-1對闊葉雜草的致病性

將青海省農林科學院試驗田間生長至4～5葉期，葉色正常的藜、冬葵、酸模葉蓼，4～6輪生葉期的豬秧秧移栽于花盆(Φ=15 cm)中，于溫室內培養；將生防真菌在PDB培養液中擴大培養120 h后，制成107個·mL-1的發酵液，噴霧接種到移栽的健康雜草植株上，每盆接種量為30 mL。以接種PDB培養液的植株作為空白對照。每處理重復3次。接種后的雜草植株置于溫室，用JBX-3.5離心式工業加濕器保持相對濕度為60%，室溫條件下，12 h光暗交替培養。7 d后調查雜草發病程度，稱鮮質量，計算發病率、鮮重防效、病情指數，所有數據采用DPS統計軟件進行差異顯著性分析。

1.5 生防菌株HZ-1對作物的安全性

將青海省5種主栽作物：春小麥(青春587)、春油菜(青雜5號)、蠶豆(青海9號)、豌豆(草原224)、青稞(北青8號)分別種植于Φ=15 cm花盆中，室內培養備用。HZ-1發酵液稀釋后按上述方法接種于到3～4葉期的作物植株上，設3次重復，接種7 d后觀察供試作物的發病情況，記載發病程度。

2 結果與分析

2.1 菌株HZ-1的形態鑒定

如圖1所示，HZ-1于PDA平板上菌落疏松，圓形。初期為白色；后期，菌落邊緣逐漸變為黑色，直至整個平板。基內菌絲及氣生菌絲發達，基內菌絲初期呈黑色，顯微觀察顯示菌絲有隔，氣生菌絲呈放射狀。分生孢子易萌發，有隔。

2.2 菌株HZ-1分子鑒定

本研究自菌株的基因組DNA中擴增到545 bp的ITS片段，與鏈格孢菌屬的ITS高度相似，其中，與Alternariasp.的同源性最高。結合形態學特征分析表明，菌株HZ-1與Alternariatenuissima為同一個屬(圖2)。

Ⅰ, 菌落形態；Ⅱ, 菌絲形態；Ⅲ, 孢子圖1 菌株HZ-1形態特征Fig.1 Morphological characteristics of strain HZ-1

2.3 生防菌株HZ-1對闊葉雜草的致病性

噴施菌株HZ-1發酵液后，5種雜草表現出不同程度的受害癥狀。豬秧秧表現為葉片卷曲，莖葉發黑，藜和酸模頂部葉片出現萎蔫，冬葵葉片褪綠變黃，刺兒菜出現大面積病斑。結合發病率、鮮重防效和病情指數綜合分析(表1)，HZ-1發酵液對豬秧秧與藜的致病效果突出，與其他闊葉雜草相比差異顯著(P<0.05)，HZ-1可作為防除豬秧秧、藜的候選菌株繼續研究。

表1 菌株發酵液對不同雜草的致病力

Table 1 Virulence of the fermentation broth of HZ-1 to different weeds

雜草發病率/%鮮重防效/%病情指數豬秧秧81.2a62.9b80.3a刺兒菜70.0bc40.1c48.6c藜85.2a72.5a84.6a酸模75.3b48.4c68.2b冬葵68.3bc59.9bc51.9c

注：同列數據后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 生防菌株HZ-1對作物的安全性

HZ-1菌株發酵液接種春小麥(青春587)、豌豆(草原224)、蠶豆(青海9號)、青稞(北青8號) 后均表現為不致病，作物長勢和株高與對照植株相比均未受影響；對春油菜(青雜5號) 有輕微的致病性，接種后3 d，5%葉片出現萎蔫，有零星斑點，后期癥狀不擴展。

3 討論和結論

近年來，ITS序列分析已成為真菌種和種下類群鑒定及親緣關系研究的常用方法[9-10]。本研究采用rDNA ITS序列比較分析，發現菌株HZ-1的ITS與鏈格孢菌屬的ITS高度相似，其中與Alternariasp.的同源性達到98%。結合菌落形態和孢子形態觀察，將潛力菌株HZ-1鑒定為極細鏈格孢菌(Alternariatenuissima)。

圖2 基于ITS rDNA序列BLAST結果構建的菌株HZ-1的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of HZ-1 based on ITS rDNA sequences after BLAST

相比化學除草劑，微生物除草劑具有選擇性強、對人畜安全、對生態環境影響小等諸多優點。對微生物除草劑的評價在理論上主要依據2條標準，即有效性和專一性[11-13]。雜草生防菌應具備既對靶標雜草具有強致病性又對作物相對安全兩大特點。本試驗選用潛力菌HZ-1噴施于闊葉雜草藜、豬秧秧、刺兒菜、酸模和冬葵后，可導致其葉片發黃枯萎甚至整株枯死，說明該菌株的致病性是非專化性的，HZ-1可作為防除闊葉雜草的候選菌株進行后續研究。在安全性方面，除對春油菜有輕微影響外，其余表現為相對安全。因此，極細鏈格孢菌HZ-1對雜草致病性的廣譜性，和對春小麥、豌豆、蠶豆和青稞的安全性，顯示了其開發為微生物源除草劑的巨大潛力。但要將HZ-1開發成生物除草劑，還需對菌株HZ-1除草效果的穩定性、持效性及其侵染闊葉雜草的作用機制進行更深入的研究。此外，根據HZ-1菌株的致病特點，有望從該致病菌的毒素中研發出新型微生物除草劑。

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(責任編輯 高 峻)

Pathogenicity of Alternaria tenuissima HZ-1 to broadleaf weeds and its safety on crops

ZHU Hai-xia， MA Yong-qiang, CHENG Liang， GUO Qing-yun*

(QinghaiAcademyofAgricultureandForestryScience，ScientificObservingandExperimentalStationofCropPestinXining，MinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofAgriculturalIntegratedPestManagementinQinghaiProvince，Xining810016，China)

Strain HZ-1 was identified through morphology observation and sequence analysis. The herbicidal activity of HZ-1 against 5 broadleaf weeds was evaluated by the pathogenicity of fermentation broth， and its safety to major crops in Qinghai was tested by pot bioassay. It was shown that strain HZ-1 was identified asAlternariatenuissima. The fermentation broth of strain HZ-1 exhibited varied pathogenicity toGaliumaparine，Cephalanoplossetosum(Willd.) Kitam，Chenopodiumalbum，Malvacrispa，Polygonumlapathifolium， and within these 4 species， the pathogenicity toGaliumaparineandChenopodiumalbumwas more severe. Strain HZ-1 was safe to major crops except spring rape. In general， strain HZ-1 was candidate of microbial herbicide against broadleaf weeds such asGaliumaparineandChenopodiumalbum.

Alternariatenuissima; broadleaf weeds; pathogenicity; crop safety

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.21

2015-09-20

國家“十二五”科技支撐計劃(2012BAD19B02)；中國科學院“西部之光”人才培養引進計劃

朱海霞(1985—)，女，青海西寧人，碩士，副研究員，主要從事雜草生物防治研究。E-mail：zhuhaixia0101@163.com

*通信作者，郭青云，E-mail：guoqingyunqh@163.com

S 451

A

1004-1524(2016)06-1037-04

朱海霞，馬永強，程亮，等.極細鏈格孢菌HZ-1對闊葉雜草的致病性及對作物的安全性評價[J].浙江農業學報，2016，28(6)： 1037-1040.