褪黑素受體Mel1a在鴨不同組織中的表達研究

王淑娟，劉文舉，劉曉麗，王立克，龐訓勝

(1.安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100； 2.華中農業大學 動物醫學院，湖北 武漢 430070)

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褪黑素受體Mel1a在鴨不同組織中的表達研究

王淑娟1，劉文舉1，劉曉麗2，王立克1，龐訓勝1

(1.安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100； 2.華中農業大學 動物醫學院，湖北 武漢 430070)

褪黑素是由松果體分泌的吲哚類激素，褪黑素通過與其受體(Mel-1a， Mel-1b and Mel-1c)結合發揮對動物的節律性，生殖調控，抗凋亡和抗氧化等調節作用。為探究Mel1amRNA和Mel1a蛋白在鴨不同組織中的表達與分布以及在各個組織的相對表達量，研究褪黑素通過Mel1a受體參與鴨的生殖調控作用及其他生物學效應奠定基礎，采集鴨心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、胰和骨骼肌肉組織，利用PCR、免疫組織化學和RT-PCR技術研究Mel1amRNA和Mel1a蛋白在鴨各組織中表達分布以及Mel1amRNA的相對表達量。研究結果表明：鴨Mel1amRNA在心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、卵巢、胰和骨骼肌組織中均存在表達；Mel1a蛋白在大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織中均有表達；Mel1amRNA定量結果表明，各組織中的Mel1amRNA表達量存在差異，大腦、肺、卵巢、脾、小腦和胰臟的相對表達量較高，而肝、骨骼肌、腎和心的相對表達量較低。褪黑素首先通過與其受體結合而發揮生理調控功能，所以通過研究Mel1amRNA和蛋白在不同組織的表達分布及其相對表達量，為研究褪黑素及其受體的生理功能如調控晝夜節律，抗凋亡、抗氧化、增強免疫力、卵母細胞成熟以及胚胎的發育探究提供基礎。

鴨；褪黑素受體1a；免疫組織化學；組織表達；熒光定量PCR

褪黑素是由松果體分泌的具有多種生物功能的吲哚類激素，并且在調控動物晝夜節律及季節性繁殖動物的生殖活動等功能具有重要的作用[1-3]。光照對褪黑素的分泌具有抑制作用，白天血液中的褪黑素的濃度要低于夜間。褪黑素發揮其多種生物學功能前提是與其受體相結合，隨著人們研究的不斷深入，褪黑素受體的相關信息已日益完善。褪黑素受體屬于G-蛋白偶聯受體家族[4-5]。在脊椎動物中褪黑素受體存在3種亞型，分別為Mel1a，Mel1b和Mel1c[6]；然而在哺乳動物中只存在2種褪黑素受體，分別為MT1和MT2，哺乳動物的MT1和MT2分別與脊椎動物中的Mel1a和Mel1b相對應[7-8]。在哺乳動物中缺失Mel1c，這可能是物種在進化過程中發生了基因的丟失。近來也有研究認為哺乳動物中存在第3種褪黑素受體，NQO2(醌類還原酶)被認為是哺乳動物的第3個褪黑素受體，但是NQO2不是G-蛋白偶聯受體家族，并且NQO2在倉鼠和兔中存在表達，而在人類中并沒有發現這種受體[9-11]。也有研究者把與褪黑素受體具有同源性的GPR50 (G protein-coupled receptor 50)作為哺乳動物的第3種受體，但是研究認為GPR50并不與褪黑素相結合，可能與MT1以異二聚體的形式相結合，從而抑制褪黑素受體MT1的活性[12-13]。Mel1a主要表達于各個物種的中樞神經系統和外周組織[4，14]。Natesan等[15]對雞的神經組織研究表明Mel1a，Mel1b和Mel1c均表達于神經組織。Rada等[16]運用免疫組化和western blot的方法研究表明在雞的眼球中存在Mel1a，Mel1b和Mel1c的表達，并且主要分布于角質層、脈絡膜、鞏膜和視網膜。然而Adachi 等[7]通過培養星形膠質細胞研究褪黑素受體的表達分布，只有Mel1a和Mel1c 2種受體，而不存在Mel1b受體。Sallinen等[17]研究兔的Mel1a mRNA 組織分布表明褪黑素受體均表達于視網膜，心肌、肝臟、哈德淚腺和小腸組織中。在哺乳動物中的研究發現Mel1a在視交叉上核、垂體和生殖系統具有較高的表達水平，這可能有褪黑素發揮生理調控機能有關[18]。Mel1a也表達于金魚的各組織中，并且在腦和視網膜的表達量明顯高于其他組織[19-21]。Mel1a表達于腦部，如下丘腦、頂蓋前區和視頂蓋，這可能與Mel1a參與視覺信息的呈遞有關[22]。

褪黑素具有廣泛的生物學功能，特別是對動物的生殖生理具有重要的調控作用。褪黑素及其受體在鴨上的研究比較少，而研究褪黑素功能的基礎是褪黑素受體的組織表達分布，研究褪黑素受體的表達分布為研究褪黑素的功能以及不同組織的表達調控具有重要的意義，本研究基于此利用免疫組織的方法研究Mel1a受體蛋白在鴨不同組織的表達分布以及RT-PCR的方法研究Mel1a的mRNA在鴨不同組織的表達分布及相對表達量，為研究Mel1a對鴨的生物學作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

選取產蛋期母鴨6只，取新鮮的心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、胰和骨骼肌肉組織于液氮中保存備用，用于提取RNA；同時采取大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織固定在多聚甲醛中用于免疫組化分析。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒購自北京天根(中國北京)、反轉錄試劑盒購自fermentas(美國)、TaqDNA 聚合酶等購自北京天根(中國北京)、dNTP Mix購自天根公司(中國北京)、免疫組化試劑盒購自武漢博士德(中國武漢)、褪黑素受體A購自北京博奧森(中國北京)，熒光定量試劑購自羅氏公司(德國)。

1.3 總RNA提取與反轉錄

將保存在液氮中的心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、胰和骨骼肌組織分別取出約50 mg，在加有液氮的研缽中用研棒研成粉末狀。然后將組織粉末轉移到裂解液中，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，提取的總RNA溶于50 μL RNasefree-H2O中，-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。將提取的各組織的總RNA，用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。反轉錄程序及條件：5.0 μL總RNA、0.5 μL Oligo(dT) 引物和6.5 μL RNasefree-H2O，65 ℃ 5 min，迅速置于冰上預冷2 min；然后加入5.0 μL M-MLV RT 5×緩沖液、1.25 μL dNTP、0.5 μL RNA酶抑制劑和1 μL 反轉錄酶，42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min，得到鴨各組織的cDNA，置于-20 ℃冰箱備用。

1.4 PCR引物設計

參考GenBank報道的原雞(Gallusgallus)(gi4538-2490)、小白鷺(Egrettagarzetta)(GI:697840607)、紅喉潛鳥(Gaviastellata)(GI:698414251)、斑尾非洲咬鵑(Apalodermavittatum)(GI:699600918)、雙領鸻(Charadriusvociferus)(GI:699659678)、絨啄木鳥(Picoidespubescens)(GI:699670255)、麝雉(Opisthocomushoazin)(GI:700395793)、啄羊鸚鵡(Nestornotabilis)(GI:701302251)和紅冠蕉鵑 (Tauracoerythrolophus)(GI:701333387)Mel1a基因序列，針對序列保守區域利用Primer 5.0軟件優化設計1對引物。引物由上海生工公司合成，見表1。

1.5 鴨Mel1a基因擴增及鑒定

以反轉錄的鴨腦組織的cDNA第1鏈為模板進行基因的擴增，PCR反應體系為：1.0 μL cDNA、10 mmol·L-1正向引物和反向引物各0.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL、2.5 μL 10×Buffer、0.5 μLTaq酶(5 U·μL-1)，加ddH2O補至25.0 μL。

表1 鴨Mel1a和GAPDH基因擴增引物

Table 1 The PCR primer for theMel1aandGAPDHgenes

基因引物退火溫度/℃Mel1a5'-GGGCCTAAGTGTCATTGGAT-3'585'-AGTAACTATGGCTATGGGAAG-3'GAP-DH5'-GTGGTGCAAGAGGCATTGCT-GAC-3'585'-GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT-3'

反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進行35個循環；最后72 ℃延伸10 min，PCR產物保存在4 ℃。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統中觀察目的片段。用凝膠試劑盒回收目的片段，并與克隆載體Pmd-18T連接，并轉化感受態細胞，鋪LB固體培養基平皿，挑取單菌落培養，以菌液為模板，用鴨Mel1a基因引物進行擴增，觀察是否有目的片段，挑選陽性菌液，送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.6 Mel1a mRNA組織表達

以反轉錄的鴨各組織的cDNA第1鏈為模板進行目的基因的擴增，PCR反應體系和反應條件同1.5節，檢測各組織中Mel1amRNA的表達。

1.7 免疫組化

免疫組化檢測鴨大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織Mel1a蛋白的表達，大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織經固定、包埋、切片、烤片；60 ℃恒溫箱中烘烤120 min、脫蠟和水化；二甲苯(20 min)→二甲苯(20 min)→無水乙醇(5 min×2次)→95%乙醇(5 min×2次)→90%乙醇(5 min)→80%乙醇(5 min)，并依次滴加抗原修復液、3%過氧化氫、5%脫脂奶粉封閉液、兔抗Mel1a多抗，再滴加生物素化山羊抗兔二抗，DAB顯色，蘇木精復染細胞核1 min，鹽酸乙醇分化、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察Mel1a蛋白的表達情況。

1.8 Mel1a基因定量檢測

Mel1a引物見表1，在熒光定量PCR 10.0 μL反應體系中加入5.0 μL含綠色熒光的2×Mix Buffer，稀釋5倍后的樣品cDNA 2.0 μL為模板，10 mmol·L-1的引物0.5 μL，補充ddH2O補至10.0 μL，分別擴增目的基因和內參基因，然后進行熒光定量PCR程序(表2)。每個樣本重復3次，反應程序如表2所示。

1.9 統計分析

采用LightCycler 480系統軟件分析熒光定量PCR數據，以大腦基因表達量為參照，應用2-ΔΔCt方法分析Mel1a基因在其他組織的相對表達量。

表2 熒光定量PCR反應程序

Table 2 Reaction program of real-time PCR

反應步驟溫度/℃時間/s循環次數/次熒光信號預孵育95301無955擴增582045在延伸階段結束時7220熔解曲線60251在溫度緩慢升高過程中冷卻40101無

采用SPSS 11.0計算重復樣品之間Ct均值以及標準差，最后使用Excel繪制Mel1a基因在鴨各組織中的相對表達柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 鴨組織總RNA的提取

提取的鴨組織總RNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，圖1中28S條帶亮度高于18S，當28S條帶的亮度約為18S亮度的2倍時，表明提取的RNA質量較好，并且沒有出現5S，表明RNA無降解，可進行下一步實驗。

2.2 鴨Mel1a基因擴增

用設計的鴨Mel1a基因引物(表1)，以鴨腦cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物大小與預期大小相符，為292 bp(圖2)。測序結果表明，PCR擴增的Mel1a基因序列與GenBank中其他物種的Mel1a同源性很高。

2.3 Mel1a mRNA組織表達譜

以鴨心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、胰和骨骼肌cDNA為模板，用設計的鴨Mel1a基因引物，進行PCR擴增，PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明鴨Mel1amRNA在鴨的各組織中均表達，但在不同組織中的表達量存在差異，脾、心、小腦、卵巢和肝的表達量相對較高，而骨骼肌的表達量相對較低(圖3)。

圖1 鴨組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from duck tissues

M: Marker 1DNA分子標記；1～5: Mel1a PCR 產物圖2 鴨Mel1a基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Mel1a detected by PCR

圖3 Mel1a基因和內參基因(GAPDH)在鴨組織中的表達Fig.3 The expression of Mel1a and GAPDH at mRNA level in duck tissues

A， 大腦；B， 肺；C， 肝；D， 骨骼??；E， 腎；F， 心；G， 胰圖4 鴨Mel1a受體蛋白在各組織中表達分布Fig.4 The expression of Mel1a in duck tissues

2.4 Mel1a受體蛋白在不同組織的表達

免疫組化結果與Mel1amRNA組織表達譜相似，鴨Mel1a受體蛋白在大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織中均存在表達(圖4)。

2.5 Mel1a mRNA在不同組織中的相對表達量

利用熒光定量PCR來檢測Mel1amRNA在各組織的相對表達量，以GAPDH基因作為內參基因，以大腦基因表達量為對照，分析Mel1a基因在鴨其他10種組織中的相對表達量，結果見圖5。Mel1a基因在所檢測的組織中均存在表達，其中大腦、肺、卵巢、脾、小腦和胰臟的相對表達量較高，而肝、骨骼肌、腎和心的相對表達量較低。

圖5 鴨Mel1a基因 mRNA相對定量結果Fig.5 The relative expression of Mel1a mRNA in duck tissues

3 討論

褪黑素是由松果體分泌的，在調控生殖生理功能中具有重要作用的吲哚類激素，褪黑素通過與其受體結合發揮調控作用。本研究以鴨不同組織的Mel1a為研究對象，利用PCR和免疫組化的方法研究Mel1amRNA和蛋白在鴨不同組織中的表達分布，以及應用定量PCR的方法研究Mel1amRNA在鴨不同組織中的相對表達量，研究結果表明鴨Mel1amRNA在心、脾、大腦、小腦、腎、肝、肺、卵巢、胰和骨骼肌組織中均存在表達；Mel1a受體蛋白均表達于大腦、肺、肝、骨骼肌、腎、心和胰組織中；Mel1amRNA定量結果表明各組織中的Mel1amRNA表達量存在差異，在大腦、肺、卵巢、脾、小腦和胰臟的相對表達量較高，而肝、骨骼肌、腎和心的相對表達量較低。褪黑素受體在鴨組織表達的廣泛性以及不同的表達量，表明褪黑素及其受體在不同組織中發揮不同的調控作用，如抗凋亡、抗氧化和免疫調節。

Mel1amRNA和蛋白在部分物種中的表達已經被鑒定，然而關于鴨的各個組織的研究還尚未見報道。Natesan等[15]對雞的Mel1amRNA在視網膜的表達分布研究表明Mel1a表達于光感受器，視網膜的內核層以及視網膜的神經節細胞層。Rada等[16]研究表明雞的眼球中存在Mel1a受體，主要分布于角質層、脈絡膜、鞏膜和視網膜然，在夜晚表達量最高，褪黑素受體在眼球中表達特別是視網膜中表達與褪黑素通過受體調控晝夜節律有關。Sallinen等[17]研究表明兔的Mel1amRNA表達于下丘腦，視網膜，心肌、肝臟、哈德淚腺和小腸組織中，下丘腦中Mel1amRNA白天和晝夜表達差異顯著。Mel1a表達于金魚的腦、視網膜、肝臟和腎臟組織中，并且在腦和視網膜的表達量明顯高于其他組織[20]。Mel1a也表達于魚腦部，如下丘腦、頂蓋前區和視頂蓋，這可能與Mel1a參與視覺信息的呈遞有關[22]。Iigo等[23]研究表明褪黑素在神經系統具有較多的結合位點。本研究與以上研究相符合，與其他組織相比Mel1a在神經系統具有較高的表達水平。Mel1a在神經系統的表達與其調控動物的晝夜節律功能有著重要的關聯，同時Mel1a通過視網膜感受外界光照的變化，參與光信號的呈遞使動物的生理行為呈現一定的節律性以及調節睡眠和神經細胞的凋亡有關[24-25]。褪黑素還可以調節腦垂體釋放促黃體素和生長激素，并且在神經內分泌的調控中具有重要的作用[1，26-27]。

褪黑素受體同樣在鳥類的免疫器官中表達，在免疫調節中起著重要的作用[28]，進一步的研究表明褪黑素可以調節樹突狀細胞、自然殺傷性細胞的活性、嗜中性粒細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞和增加抗原遞呈細胞MHCⅡ的表達以及細胞因子IL-1，IL-6，TNF a的表達[29-33]，本研究發現Mel1amRNA表達于免疫器官脾和肝組織上，這與褪黑素及其受體在免疫調節上的作用相符合。因此，褪黑素可能通過其受體在調節免疫器官增強免疫細胞的活性以及增加免疫因子的分泌具有重要作用。

褪黑素是由松果體分泌的然后通過調節下丘腦—垂體—性腺軸，調節繁殖動物的生殖功能，而對于雌性動物主要通過調節卵巢的功能來實現。本研究發現Mel1amRNA和蛋白在鴨卵巢中均存在并且在卵巢中有較高的表達水平。以前的研究表明褪黑素受體在其他物種的卵巢中表達，鼠和人的卵巢中存在Mel1a表達[34-35]，褪黑素受體在牛卵母細胞和胚胎中也均有表達[36-37]。我們以前的研究表明Mel1a在牛卵巢顆粒細胞中存在表達[38]。Chowdhury等[39]在鳥類生殖系統中研究發現褪黑素及其受體可促進顆粒細胞及卵母細胞的發育和成熟，能調節類固醇激素的合成。褪黑素及其受體通過對卵巢功能的調節如卵母細胞的成熟以及激素的分泌和胚胎的發育，進而調控動物的繁殖性能。褪黑素首先通過與其受體結合而發揮生理調控功能，所以本研究通過研究Mel1amRNA和受體蛋白在不同組織的表達分布，為研究褪黑素及其受體的生理功能如調控晝夜節律，抗凋亡、抗應激、增強免疫力、卵母細胞成熟以及胚胎的發育探究提供基礎。

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(責任編輯 張 韻)

Study on expression of melatonin receptor Mel1a in several duck tissues

WANG Shu-juan1， LIU Wen-ju1， LIU Xiao-li2， WANG Li-ke1， PANG Xun-sheng1

(1.CollegeofAnimalScience，AnhuiScienceandTechnologyUniversity，Fengyang233100，China; 2.CollegeofAnimalScience，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

Melatonin is an indole hormone secreted by the pineal gland， and involved in regulating the circadian， seasonal reproduction， antioxidant activity and anti-apoptosis. The present study investigated the expression， distribution and relative expression quantity ofMel1amRNA and Mel1a protein in different organs of duck， which laid the foundation for further study on regulating effect of melatonin on the reproductive physiology and other biological function. In this study， we collected the heart， spleen， brain， cerebellum， kidney， liver， lung， ovary， pancreas and muscle tissues of duck. The expression of Mel1a in duck tissues were detected by the methods of PCR and immunohistochemical techniques at mRNA and protein levels. TheMel1amRNA relative expression quantities in different organs were detected by real-time PCR. The major results were described as follows:Mel1amRNA was expressed in the heart， spleen， brain， cerebellum， kidney， liver， lung， ovary， pancreas and muscle tissues of duck. Mel1a protein was expressed in the brain， lung， liver， muscle， kidney， heart and pancreas tissues of duck. Moreover， real-time quantitative PCR was used to detect the relative expression level ofMel1agene in different tissues and the gene expression level in brain was selected as a baseline. The quantitative results showed thatMel1agene had high expression levels in brain， lung， ovary， spleen， cerebellum and pancreas and low levels in kidney， liver， muscle and heart. Melatonin plays an important role in physiological regulation function by binding to its receptors and it is very important to study the melatonin receptor expression and distribution， which are useful to elucidate the role and mechanism of melatonin on circadian rhythm， anti-apoptosis， antioxidant activity， enhancing immunity， oocyte maturation and embryo development.

duck; Mel1a; immunohistochemistry; tissue expression; fluorescent quantitative PCR

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.05

2016-02-18

國家自然科學基金項目(31301972)；安徽省自然科學基金項目(1308085QC66)；安徽省教育廳自然科學基金項目(kj20136077)

王淑娟(1983—)，女，山東菏澤人，博士，講師，從事動物生殖生理與繁殖研究。E-mail：wangshujuan2012@hotmail.com

S834

A

1004-1524(2016)06-0928-07

王淑娟，劉文舉，劉曉麗，等. 褪黑素受體Mel1a在鴨不同組織中的表達研究[J].浙江農業學報，2016，28(6)： 928-934.