實時熒光定量PCR法檢測草莓鑲脈病毒

苗立祥，榮寧寧，2，張豫超，楊肖芳，張 琴，張慧琴，蔣桂華，*

(1.浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 3.舟山市定海區農業技術推廣中心站，浙江 舟山 316000)

?

實時熒光定量PCR法檢測草莓鑲脈病毒

苗立祥1，榮寧寧1，2，張豫超1，楊肖芳1，張 琴3，張慧琴1，蔣桂華1，*

(1.浙江省農業科學院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 3.舟山市定海區農業技術推廣中心站，浙江 舟山 316000)

為了建立一種特異、靈敏、快速檢測草莓鑲脈病毒(Strawberryveinbandingvirus，SVBV)的SYBR Green-Ⅰ實時熒光定量PCR方法，根據已有的檢測SVBV的引物信息，合成引物，對不同草莓品種進行PCR擴增。經過克隆、測序及序列比對得到了感染SVBV的陽性植株，利用此植株PCR擴增產物構建重組質粒作為標準品，優化了PCR反應體系，標準曲線的循環閾值(Ct值)與模板濃度有良好的線性關系(R2=0.999 1)；進行了靈敏度和重復性試驗，敏感性可達到101拷貝·μL-1，約為普通PCR的1 000倍，重復性好；并與常規PCR方法進行了比較，成功建立了檢測SVBV的實時熒光定量PCR法。用該方法檢測了部分草莓品種的DNA樣品，結果表明，大部分植株都帶有SVBV。該方法具有很高的靈敏性和重復性，可用來快速檢測草莓植株是否感染SVBV。

草莓鑲脈病毒；SYBR Green-Ⅰ；實時熒光定量PCR

目前，草莓(Fragaria×ananassaDuch.)生產上用的種苗主要以匍匐莖繁殖為主，即常將上一年的生產株作為母株進行種苗生產。這樣經過多年的生產和繁育后，草莓植株很容易感染上病毒，一旦感染病毒便會世代相傳，導致植株矮化，匍匐莖發生減少，果實品質變劣，產量嚴重下降。

迄今為止，世界上已經鑒定出的為害草莓種植的病毒、類病毒和菌原體等有25種之多。在我國，為害草莓的病毒病主要有4種：草莓斑駁病毒病、草莓輕型黃邊病毒病、草莓皺縮病毒病和草莓鑲脈病毒病。據調查，草莓帶病毒株率高達80.2%，單種病毒侵染株率為41.6%，2種以上病毒復合侵染株率為38.6%[1]。草莓鑲脈病毒(strawberryveinbandingvirus，SVBV)在分類上屬于花棷菜花葉病毒科(Caulimovidae)花棷菜花葉病毒屬(Caulimovirus)[2]，是一種為害草莓的潛隱性雙鏈DNA病毒，主要通過嫁接傳染或通過蚜蟲以非持久性方式傳播[3]，在世界上廣泛存在，是草莓生產的主要病毒病害之一[4-5]。該病毒粒子呈球狀，直徑45～50 nm，基因組為環狀雙鏈DNA[6]，共有7個開放閱讀框(open reading frame， ORF)，每個ORF都具有不同的功能，其中ORF Ⅵ編碼病毒粒子包涵體基質蛋白，可能與致病性有關，所編碼的外殼蛋白在SVBV中的保守性較好，成為PCR法檢測病毒設計引物的首選區域[7-8]。

解決病毒為害草莓生產的關鍵是推廣使用無病毒苗，實行無毒化生產。培育草莓無毒苗的脫毒技術有微莖尖組織培養法、熱處理法、化學治療結合組織培養法、花藥組織培養法等。其中，用莖尖組織培養法進行無病毒苗的培育，是目前世界上獲得草莓無毒苗最普通且有效的方法[9-11]。通過這類方法得到的草莓苗在進行繁育之前都需要經過病毒檢測。

草莓病毒的檢測方法主要有ELISA、指示植物小葉嫁接、PCR等方法[2-6]，這些方法在草莓病毒檢測上都有一定的應用，然而在檢測速度、靈敏度、季節性及特異性等方面仍有一定的局限性。目前，熒光定量PCR由于其靈敏度高、特異性強、重復性好等優點，在病毒檢測中已得到廣泛應用[12-14]，但在草莓鑲脈病毒檢測中仍未見報道。本研究利用位于ORF Ⅳ上檢測SVBV的引物作為實時熒光定量PCR反應的特異性引物，建立了栽培草莓中SVBV的實時熒光定量PCR檢測方法，為草莓病毒的檢測提供了可靠的參考方法，也為SVBV診斷試劑盒的研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品與主要儀器

草莓嫩葉采自浙江省農業科學院楊渡創新基地，共20個品種，分別為紅顏、章姬、達賽萊克特、鬼怒甘、弗吉尼亞、紅花、頰豐、幸香、豐香、越麗、越珠、甜查理、鳳冠、寶交早生、甘王、紅實美、石莓4號、佐賀清香、雪妹、本尼西亞。

實時熒光定量PCR儀型號為羅氏LightCycler 96。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物合成

根據已經發表的文獻[15-16]，合成引物I2∶5′-GAATGGGACAATGAAATGAG-3′與SM2∶5′-AACCTGTTTCTAGCTTCTTG-3′，引物純化方式為HPLC，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 模板DNA的提取制備

采用CTAB法提取草莓葉片DNA[17]，DNA用電泳和NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific公司)進行檢測，用ddH2O稀釋到5 ng·μL-1進行實時熒光定量PCR檢測。

1.2.3 感染SVBV植株的獲得與克隆測序

利用I2/SM2引物進行擴增，PCR產物電泳完成后，切取符合目標產物大小的片段，進行產物回收，然后進行TA克隆，挑選白色克隆菌送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將所得到的測序結果與NCBI數據庫和草莓基因組信息進行比對，以確定所得到的序列是否為SVBV序列。

1.2.4 質粒標準品的制備

將陽性克隆進行搖菌并提取質粒，用NanoDrop 2000進行濃度檢測，將濃度換算成拷貝·μL-1后，10倍梯度稀釋成108～100拷貝·μL-1，作為質粒標準品用于熒光定量PCR反應。

1.2.5 熒光定量PCR反應條件的優化與標準曲線的制作

以制備的標準品為模板，對實時熒光定量PCR反應體系中的引物及退火溫度進行優化，確立最佳的反應體系。經優化后，20 μL標準反應體系：2×Fast Start Master 10 μL，引物I2和SM2各1 μL(濃度為10 mmol·L-1)，模板2 μL，加滅菌的ddH2O至20 μL。反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，45個循環。熔解曲線反應條件為95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。以稀釋成108～100拷貝·μL-1的質粒標準品進行熒光定量PCR反應，試驗重復5次以確定最終標準曲線。

1.2.6 熒光定量PCR靈敏性和重復性試驗

用SVBV質粒標準品進行熒光定量PCR和普通PCR試驗，根據各模板的Ct值確定檢測下限。以105拷貝·μL-1為模板，重復10次，進行統計分析，根據變異系數確定該體系的可重復性。

1.2.7 熒光定量PCR檢測SVBV的實際應用

采集不同草莓品種植株葉片，抽提DNA為模板，進行熒光定量PCR，以確定植株感染率。

2 結果與分析

2.1 SVBV病毒植株的獲得

以I2和SM2為引物對提取的DNA進行常規PCR反應，發現很多品種的草莓植株都有陽性條帶擴增，其中，以達賽萊克特和鬼怒甘品種擴增出的陽性率最高，每個植株都有陽性條帶擴出(圖1)。

每個草莓品種選取5個擴增出陽性條帶的菌液進行克隆測序，結果表明，所得序列基本一致，長度為278 bp，僅有幾個SNP位點，最終以下面的序列為標準構建重組質粒：

5′-GAATGGGACAATGAAATGAGATTAATCATTAAAACAGAGAAGGCTCTTACAAATGATTT-

TGATCTTATCCTTACTCTCGCAAAGAGTAAAACA-

GTTGGCAATGCCAAACAATTGTTGGAATCACTTC-

ACACTGATGCCTTCAAACAAGCTTCTTCAACAG-

GAGAAGAATTTTTGACAACTCTAACAAATTCGT-

TTTATACTATATTTGTTGGAACTAACTATCTTAC-

ACAGGGAACCCGTGAAAAGGAGAAAGCTGTGC-

AAGAAGCTAGAAACAGGTT-3′。

2.2 質粒標準品的制備

P， 陽性對照；N， 陰性對照；M， DL 2 000 DNA marker；Actin，內參；1—10， 達賽萊克特單株；11—20， 鬼怒甘單株圖1 部分草莓品種的SVBV PCR檢測Fig.1 The detection of SVBV in some strawberry varieties using PCR

重組質粒分子量=(3953+278)×324.5×2=2745919 u；

分子組質粒的質量為2745919/(6.02E+23)=(4.56132E+9) ng；

1 ng重組質粒的分子數=1 ng /4.56132E+9 ng ≈ 2.19235E+8。

根據NanoDrop 2000檢測結果，將質粒以10倍梯度稀釋成108～100拷貝·μL-1備用。

2.3 標準曲線的建立

以構建的草莓SVBV重組質粒DNA為模板進行熒光定量PCR，得到SVBV的標準曲線(圖2)，拷貝數為108～101拷貝·μL-1，與Ct值呈現良好的線性關系(本試驗中Ct值>40視為陰性)。

2.4 熒光定量PCR的重復性

x： 病毒分子拷貝數。圖2 熒光定量PCR檢測草莓鑲脈病毒標準曲線Fig.2 Standard curve of the real-time PCR of SVBV detection

為了證實SVBV方法的穩定性，對3個標準樣品和達賽萊克特品種3個樣品分別進行了4批批內和批間的重復性試驗。結果表明，批內變異系數和批間變異系數均較小(表1)，差異多是由槍頭誤差引起的，表明本檢測方法的重復性良好。

1.解放思想，轉變觀念。基層畜牧管理部門要順應畜牧業發展的需要，改變傳統服務方式，轉變服務觀念，要堅決摒棄疆化保守的小農經濟服務意識，面對不斷出現的新問題、新難題，要及時調整思路，主動適應市場需求和群眾需要，這樣才能跟上形勢的發展。

表1 熒光定量PCR檢測草莓SVBV方法的重復性

Table 1 The duplication detection of SVBV detection by real-time PCR

樣品序號平均病毒載量/(拷貝·μL-1)重復次數批間重復值平均Ct值變異系數/%批內重復值平均Ct值變異系數/%1108414.830.6714.810.972104427.691.5227.591.063102434.281.9634.182.3143.77×101435.563.2135.983.5652.12×104426.581.0326.681.3464.46×106419.090.2319.341.45

2.5 熒光定量PCR的靈敏性

用常規PCR檢測重組質粒時，濃度低于104拷貝·μL-1時，電泳條帶不清晰(圖3)，無法判斷是否有條帶。用實時熒光定量PCR檢測時，雖然100拷貝·μL-1有擴增曲線，但平臺期與SVBV檢測引物不相符，故能檢測出的模板最低濃度為101拷貝·μL-1，說明熒光量PCR的敏感性約是常規PCR的1 000倍。

2.6 熒光定量PCR檢測SVBV病毒植株的應用

提取不同植株葉片DNA，分別進行常規PCR(圖5)和實時熒光定量PCR(圖6)，有4個植株通過常規PCR檢測到了條帶，7株隱約有條帶，其他不確定是否感染SVBV。利用所建立的實時熒光定量檢測法進行分析時發現，所有植株樣品均擴增出目的條帶，表明均感染SVBV。

M, DL 2 000 DNA marker；P, 陽性對照；N, 陰性對照；0—8, 對應的重組質粒模板濃度依次為100，101，102，103，104，105，106，107，108拷貝·μL-1圖3 標準樣品PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Detection of PCR product by agarose gel electrophoresis

曲線0—8, 對應的重組質粒模板濃度依次為100，101，102，103，104，105，106，107，108拷貝·μL-1；N, 陰性對照圖4 熒光定量PCR法對10倍梯度稀釋質粒的檢測結果Fig.4 Detection results of the stand recombinant with 10 fold serial dilutions by the real-time PCR assay

表2 熒光定量PCR和普通PCR的敏感性試驗

Table 2 Sensitivity comparison between real-time PCR and the routine PCR of SVBV detection

質粒標準樣品/(拷貝·μL-1)熒光定量PCR普通PCR108++107++106++105++104++103+-102+-101+-100--

1—5, 紅顏；6—10, 章姬；11—15, 頰豐；16—20, 越麗圖5 部分草莓品種SVBV常規PCR檢測結果Fig.5 Routine PCR amplification of the strawberry cultivars

1—5, 紅顏；6—10, 章姬；11—15, 頰豐；16—20, 越麗；N, 陰性對照圖6 部分草莓品種的熒光定量PCR擴增曲線Fig.6 Amplication of real-time PCR of strawberry cultivars

分別利用熒光定量PCR和普通PCR檢測了20個草莓品種是否感染SVBV，每個品種檢測30株，結果如表3所示。普通PCR和熒光定量PCR在達賽萊克特、鬼怒甘和弗吉尼亞上的檢測結果一致，檢出率為100%；在其他品種上，熒光定量PCR的檢出率高于普通PCR，其中在頰豐上最為明顯，比常規PCR高40%。

表3 熒光定量PCR和普通PCR檢測的草莓SVBV發病率

Table 3 The incidence of SVBV in strawberry cultivars using real-time PCR and the routine PCR

品種檢出率/%熒光定量PCR常規PCR紅顏93.3373.33章姬100.0086.67達賽萊克特100.00100.00鬼怒甘100.00100.00弗吉尼亞100.00100.00紅花86.6766.67頰豐93.3353.33幸香90.0060.00豐香100.0083.33越麗83.3363.33越珠93.3370.00甜查理96.6793.33鳳冠93.3390.00寶交早生100.0093.33甘王86.6780.00紅實美100.0090.00石莓4號100.0080.00佐賀清香100.0083.33雪妹93.3370.00本尼西亞100.0083.33

3 討論

植物病毒病在很多作物生產中是一個嚴重的威脅[3，10，16，18]，同樣也威脅著草莓的生產。草莓病毒主要通過蚜蟲以非持久性方式傳染，人工接種也可以通過嫁接傳染。然而，單一草莓病毒侵染草莓時的癥狀并不明顯，與其他病毒復合侵染時可表現出葉脈間黃化、葉緣黃化鑲邊、匍匐莖數量減少等癥狀[19]。由于病毒在草莓植株體內擴散速度慢，而且草莓苗基本是一年一輪換，即使有癥狀也往往被人們忽視。在草莓生產上，雖然組培快繁技術應用得比較廣泛，但只是作為一項加速繁殖草莓苗的技術，真正經過檢測的脫毒苗還較少。

草莓病毒的檢測方法除了常規的ELISA法、PCR法、指示植物小葉嫁接等外，隨著高通量測序技術的大量應用，在進行基因組或轉錄組測序的同時，也能夠把病毒的序列檢測出來，是當前靈敏度較高、較可靠的技術，然而因其成本高，還不適用于大規模檢測服務[20]。實時熒光定量PCR將PCR與熒光檢測方法相結合，其自動化操作提高了工作效率，反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰，極大地簡化了定量檢測的過程，操作成本也越來越低，在臨床疾病診斷、動物疾病檢測、食品安全以及醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究中得到了廣泛應用[21-24]。

本研究利用前人檢測SVBV的引物序列合成PCR引物，用這對引物篩選了試驗園內的草莓品種，得到了與目標產物大小一致的PCR產物。克隆、測序、比對后得到了陽性SVBV序列，用陽性菌液提取質粒作為標準樣品，在優化反應體系，進行了靈敏度和重復性實驗，并與普通PCR進行了比較，成功建立了實時熒光定量PCR檢測SVBV的方法。利用建立的實時熒光定量PCR檢測SVBV的標準方法檢測了部分草莓植株感染鑲脈病毒的情況，結果表明，大部分品種都感染了SVBV，感染程度有一定的差異。

熒光定量PCR方法的高靈敏性與熒光PCR所用的熒光染料的高靈敏性有關，還可能與質粒的質量比較高有一定的關系。因為一般植物樣品在提取DNA后，雖然檢測的D值或濃度比較理想，仍然會殘留一些影響PCR反應的因素[25-26]。

實時熒光定量PCR在檢測過程中，相同模板不同批內重復和批間重復會存在差異，一般是由以下原因造成的[27]：(1)人為加樣誤差；(2)移液器本身的吸液差異；(3)PCR儀的邊緣效應；(4)熒光染料差異。可以通過以下方法來減少誤差：(1)每次加樣時動作標準，移液器使用規范，可以使用反向吸液與預潤濕吸液方式結合；(2)盡量使用與移液器完全匹配且質量高的吸頭，以減少吸頭上的殘留；(3)使用高質量的PCR管或PCR板，使液體盡量完全離心到管體；(4)選擇高質量的熒光定量試劑，在條件允許的情況下，PCR反應體系盡量大，模板與引物的母液濃度盡量低，保證每次吸液量都在最大值。

本研究建立的SYBR熒光定量PCR方法，可以檢測草莓中的SVBV，并可對其絕對定量，也可用于研究SVBV在植株體內的運動情況、抗病種質資源選育以及草莓脫毒檢測等。

[1] 王國平， 劉福昌， 薛光榮，等. 草莓病毒種類鑒定及培育無病毒種苗的技術研究[J]. 中國農業科學， 1990，23 (4): 43-49.

[2] 洪健. 植物病毒分類圖譜[M]. 北京: 科學出版社， 2001: 40-42.

[3] PETRZIK K，IMRZI， et al. Quarantinestrawberryveinbandingvirusfirstly detected in Slovakia and Serbia [J].ActaVirologica， 1998， 42(2): 87-89.

[4] 王國平， 劉福昌， 國際翔. 我國草莓主栽區病毒種類的鑒定[J]. 植物病理學報， 1991， 21(1): 9-14.

[5] RATTI C， PISI A， AUTONELL C R， et al. First report ofStrawberryveinbandingvirus on strawberry in Italy [J].PlantDisease， 2009， 93(6): 675.

[6] STENGER D C， MULLIN R H， MORRIS T J. Isolation， molecular cloning， and detection ofstrawberryveinbandingvirusDNA [J].Phytopathology， 1988， 78(2): 154-159.

[7] PAPPU H R， DRUFFEL K L. Use of conserved genomic regions and degenerate primers in a PCR-based assay for the detection of members of the genusCaulimovirus[J].JournalofVirologicalMethods， 2009， 157(1): 102-104.

[8] 江彤， 謝朝陽， 丁菲， 等. 草莓鑲脈病毒ORF Ⅵ基因的原核表達與抗血清制備[J]. 植物保護學報， 2013， 40(6): 512-516.

[9] 孟志卿. 草莓花藥組織培養脫毒快繁技術研究[J]. 安徽農業科學， 2008， 36(2): 440-441.

[10] 孫崇波， 蔣桂華， 施季森， 等. 不同外植體對草莓病毒脫除效果及病毒的多重RT-PCR檢測[J]. 核農學報， 2008， 22(4): 447-450.

[11] 孟靜靜， 徐平麗， 郭峰， 等. ‘豐香’草莓高效脫毒及快速繁殖技術研究[J]. 安徽農業科學， 2009， 37(35): 17346-17347.

[12] AMMANN T W， BOSTANCI N， BELIBASAKIS G N， et al. Validation of a quantitative real-time PCR assay and comparison with fluorescence microscopy and selective agar plate counting for species-specific quantification of aninvitrosubgingival biofilm model [J].JournalofPeriodontalResearch， 2013， 48(4): 517-526.

[13] 韓宏宇， 馬秀麗， 黃兵， 等. 用熒光定量RT-PCR方法檢測新型鴨呼腸孤病毒[J]. 浙江農業學報， 2015， 27(8): 1331-1336.

[14] 袁秀芳， 路斌， 徐麗華， 等. 一步法CSFV和PRRSV雙重實時熒光定量RT-PCR診斷方法的建立與初步應用[J]. 浙江農業學報， 2015， 27(4): 537-543.

[15] MARTIN R R， TZANETAKIS I E. Characterization and recent advances in detection of strawberry viruses [J].PlantDisease， 2006， 90(4): 384-396.

[16] 肖敏， 張志宏. 草莓鑲脈病毒研究進展[J]. 遼寧農業科學， 2005 (4): 36-38.

[17] 肖敏， 張志宏， 代紅艷， 等. PCR檢測草莓鑲脈病毒的穩定性研究[J]. 果樹學報， 2005， 22(5): 483-487.

[18] 周厚成， 李思源， 何水濤， 等. 草莓鑲脈病毒的PCR檢測及特異片段的序列分析[J]. 果樹學報， 2005， 22(3): 286-288.

[19] 王正華， 邵永春. 草莓病毒的檢測方法及癥狀識別[J]. 山東農業科學， 1999 (1): 31-33.

[20] 楊肖芳， 苗立祥， 張豫超， 等. 浙江省紅顏草莓鑲脈病毒(SVBV)的調查與莖尖脫毒技術研究[J]. 核農學報， 2015， 29(9): 1694-1700.

[21] 李茜， 劉偉， 郭榮君， 等. 毛桃種子表面根癌土壤桿菌的熒光定量PCR檢測[J]. 果樹學報， 2014, 31(3): 501-507.[22] CECILIA D， KAKADE M， ALAGARASU K， et al. Development of a multiplex real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of dengue and chikungunya viruses [J].ArchivesofVirology， 2014， 160(1): 323-327.

[23] SCHEFE J H， LEHMANN K E， BUSCHMANN I R， et al. Quantitative real-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel “gene expression’s CT difference” formula [J].JournalofMolecularMedicine， 2006， 84(11): 901-910.

[24] RUIZ-RUIZ S， MORENO P， GUERRIJ， at al. A real-time RT-PCR assay for detection and absolute quantitation ofCitrustristezavirusin different plant tissues [J].JournalofVirologicalMethods， 2007， 145(2): 96-105.

[25] 朱海生， 花秀鳳， 陳敏氡， 等. 四種草莓病毒SMoV、SVBV、SCV、SMYEV多重RT-PCR檢測[J]. 核農學報， 2013， 27(11): 1630-1635.

[26] CHANG L， ZHANG Z， YANG H， et al. Detection of strawberry RNA and DNA viruses by RT-PCR using total nucleic acid as a template [J].JournalofPhytopathology， 2007， 155(7/8): 431-436.

[27] 鄭衛東， 袁仕偉. 熒光定量PCR儀的邊緣效應與實驗誤差分析[J]. 醫療衛生裝備， 2013 (2): 113-115.

(責任編輯 侯春曉)

Real time fluorescent quantitative PCR for detection ofStrawberryveinbandingvirus

MIAO Li-xiang1， RONG Ning-ning1，2， ZHANG Yu-chao1， YANG Xiao-fang1， ZHANG Qin3， ZHANG Hui-qin1， JIANG Gui-hua1，*

(1.InstituteofHorticulture，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 2.SchoolofChemicalandLifeSciences，ZhejiangNormalUniversity，Jinhua321004，China; 3.DinghaiDistrictAgriculturalTechnologyExtensionCenterStationofZhoushanCity，Zhoushan316000，China)

To develop a highly sensitive and specific real-time quantitative PCR method with SYBR Green-Ⅰ to quantifyStrawberryveinbandingvirus(SVBV)， a pair of primers which were reported to screen strawberry SVBV samples of different cultivars was synthesized. Positive PCR products were cloned and sequenced by TA clone technology. The sequences were blasted with those in NCBI database and strawberry genome in GDR database. Results showed that the cloned sequences showed high levels of identity withStrawberryveinbandingvirussequences. This fragment was cloned using pEASY-T5 Zero vector to construct the recombinant plasmid which was used as a standard recombinant plasmid. The reaction system was optimized. The sensitivity and repeatability were evaluated. Leaves of strawberry plants were detected by the SYBR Green-Ⅰ real time fluorescent quantitative PCR assay in contrast to the routine PCR method. The results indicated that the real-time PCR assay with a quantitative standard curve of good linearity (R2=0.999 1) was successfully established. The sensitivity of detection limit could reach 101copies·μL-1， and it was about 1 000 times of the routine PCR. The real-time PCR assay was evaluated with some strawberry samples collected from field. This method had high sensitivity and stability， and could be used in SVBV infection diagnosis and investigation.

Strawberryveinbandingvirus；SYBR Green Ⅰ; real-time fluorescent quantitative PCR

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.20

2015-10-09

國家自然科學基金項目(31201613)；浙江省農業科學院人才培養項目(2015R05R08E01)；浙江省自然科學基金項目(LY16C150004)；浙江省農業新品種選育專項(2012C129048)

苗立祥(1981—)，男，山東蒙陰人，博士，助理研究員，從事草莓品質生理與分子生物學研究。E-mail：mlx.123@163.com

*通信作者，蔣桂華，E-mail：jgh2004267@sina.com

S668.4

A

1004-1524(2016)06-1030-07

苗立祥， 榮寧寧， 張豫超， 等. 實時熒光定量PCR法檢測草莓鑲脈病毒[J]. 浙江農業學報， 2016， 28(6): 1030-1036.