基于ISSR分子標記的茶樹品系麗早香遺傳特性分析

潘建義 ，成 浩，王麗鴛，馬軍輝

(1.浙江省麗水市農業局農作物站，浙江 麗水323000； 2.中國農業科學院 茶葉研究所/國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008)

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基于ISSR分子標記的茶樹品系麗早香遺傳特性分析

潘建義1，成 浩2，*，王麗鴛2，馬軍輝1

(1.浙江省麗水市農業局農作物站，浙江 麗水323000； 2.中國農業科學院 茶葉研究所/國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008)

麗早香是浙江省麗水市選育的茶樹品系，研究其遺傳特性及與其他茶樹品種差異性，是申請植物新品種保護和開展新品種審定的重要判定依據。以浙江麗水主栽品種嘉茗1號(烏牛早)、迎霜、龍井43和當地群體種(鳩坑)為比較對象，采用改進的CTAB法提取上述4個品種和麗早香(山地種和大田種)6個材料的總DNA，應用簡單重復區間序列(ISSR)標記的方法，分析了麗水本地品系麗早香的遺傳特性。結果表明：麗早香在不同栽培環境中基因型沒有差異，是一個穩定的品系；而且，麗早香與嘉茗1號(烏牛早)的親緣關系最近，與龍井43的親緣關系最遠，與迎霜和當地群體種的親緣關系介于兩者之間。

麗早香；ISSR；遺傳多樣性；親緣關系

簡單重復區間序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)標記是以加錨SSR(simple sequence repeats)寡聚核苷酸為引物，對位于反向排列的SSR之間的DNA序列進行PCR擴增的一種分子標記技術。許多研究表明，應用分子標記建立指紋圖譜是進行作物品種鑒別的有效工具。在茶樹資源上，已采用RAPD，AFLP，RFLP和ISSR等標記技術進行遺傳多樣性、親緣關系分析以及品種資源的分子鑒別研究[1-7]。

麗早香是浙江省麗水市選育出來的早生茶樹品系，幾年來以其早生優質，特別適合采制螺形名茶、半烘炒香茶和扁形名茶等名優綠茶而深受當地茶農青睞。該品系在生產中為茶農帶來了高收益，具有較大開發利用價值。為了更好地推廣應用該品系，本試驗應用ISSR分子標記技術對麗早香與麗水市主栽品種的遺傳差異進行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料采自浙江省麗水市蓮都區老竹鎮獅子山村，并用本地主栽品種嘉茗1號(烏牛早)、迎霜、龍井43和當地群體種(鳩坑)4個品種作為對照，采摘1芽3葉鮮葉，-20 ℃保存備用。

1.2 引物

參照劉本英等[8]采用的引物，由上海生物工程技術服務公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組的提取、檢驗

采用CTAB改進法提取DNA，具體參照劉本英等[8]方法。純化DNA并稀釋100倍，采用分光光度計測定D260和D280值，以確定DNA純度和濃度；DNA樣品在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳(電壓2～5 V·cm-1，終濃度為0.6 μg·mL-1的EB染色)，然后在Bio-Rad凝膠成像儀上檢驗DNA質量。將DNA配制成濃度為40 ng·μL-1的模板DNA[8]。

1.3.2 ISSR-PCR方法和產物檢測

ISSR-PCR 10 μL反應體系：1.0 μL 40 ng·μL-1模板DNA、0.6 μL 10 μmol·L-1引物、1.0 μL 10×PCR反應緩沖液、0.8 μL 25 mmol·L-1Mg2+、0.2 μL 10 nmol·L-1dNTP，0.1 μL 5 UTaqDNA聚合酶(Promega) 、6.3 μL ddH2O。

PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；然后進入下列循環：94 ℃變性1 min，52～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，39個循環；循環結束后72 ℃延伸7 min。擴增后PCR產物在4 ℃保存。產物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓150 V，4 h)檢測，銀染顯色，用Bio-Rad凝膠成像儀拍照記錄。

語相指的是整個書寫系統，包括拼寫、標點符號、段落編排等。劉世生把書寫系統定義為語言的視覺中介，即標點、排版、字母和段落結構，以及詩歌中的長短行，還包括圖畫和圖像[7]。語相跟文體有密切的聯系，語相的特殊效果可以表達一些用常規的方式無法得到的意義。

1.3.3 數據處理與分析

用DL2000作為分子量標記，全部材料在重復擴增中穩定出現條帶賦值為1，不出現賦值0，統計結果用于聚類分析；擴增結果采用Nei相似系數(GS)的計算方法，得到供試材料相似性矩陣，應用公式GD=1-GS計算出遺傳距離矩陣，采用UPGMA聚類分析方法構建分子系統樹狀圖[8]。利用Popgene32 和NTSYS-pc 2.1軟件進行數據統計。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取與檢驗

采用改良的CTAB法得到的總DNA，檢測譜帶清晰，亮度好(圖1)，D260/D280值(吸光法檢測)在1.82～1.87之間，平均1.84，提取的總DNA純度好、質量較高，可用于ISSR分子標記分析。

2.2 ISSR-PCR擴增分析

前后選用15對ISSR引物對2個麗早香樣本及4個對照品種樣本進行擴增，4對引物能有效地區分6個樣本(圖2)。其中，麗早香大田樣與山地樣的擴增譜帶基本一致，說明該材料在不同栽培環境中基因型沒有變化，是一個穩定的品系；而麗早香擴增譜帶與4個對照品種樣品明顯不同，說明它們在遺傳組成上確有差異。

2.3 遺傳距離與遺傳一致度分析

對6個樣本遺傳距離的分析結果表明，6個材料間的遺傳距離范圍在0.113 3～0.387 8之間，平均為0.280 0。麗早香與迎霜、嘉茗1號(烏牛早)之間的遺傳距離較小，而與龍井43之間的遺傳距離最大，為0.387 8，表明它們之間的遺傳差異明顯(表1)。6個樣本的遺傳一致度范圍在0.678 6～0.892 9之間，平均為0.760 0。與遺傳距離的結果相一致，麗早香與龍井43之間的遺傳一致度最小，為0.678 6，與龍井43和迎霜等其他3個樣本間的遺傳一致度比龍井43更大一些(表1)。

1.當地群體種(鳩坑)；2.麗早香(山地)；3.嘉茗1號(烏牛早)；4.迎霜；5.麗早香(大田)；6.龍井43。下同。圖1 六個樣本DNA電泳圖譜Fig.1 DNA electrophoresis of 6 samples

圖2 四個能有效區分6個樣本的引物的PCR電泳圖譜Fig.2 ISSR PCR fingerprints of 6 samples of tea using 4 primes

利用ISSR標記數據計算出6個樣本間的遺傳相似系數，并采用UPGMA法構建6個樣本的遺傳關系聚類圖(圖3)。從相似系數分析可以看出，除2個麗早香樣本外，嘉茗1號與麗早香的相似系數(分別為0.847 290 6和0.858 490 6)為所有對照材料中最高的，表明嘉茗1號與麗早香之間的親緣關系較其他材料可能更近一些(表2)。

表1 六個樣本的Nei遺傳距離(對角線下方)和遺傳一致度(對角線上方)

Table 1 Neil’s genetic distances (below the diagonal) and genetic identity (above the diagonal) of 6 samples

樣本1234561****0.71430.77860.79290.73570.721420.3365****0.77860.79290.89290.678630.25030.2503****0.75710.78570.757140.23210.23210.2782****0.75710.700050.30690.11330.24120.2782****0.714360.32650.38780.27820.35670.3365****

圖3 六個樣本基于ISSR標記的聚類圖Fig.3 Dendrogram for tea genotypes obtained using the unweighted pair group method with arithmatic average (UPGMA) of 6 tested samples based on ISSR polymorphism

表2 六個樣本的相似系數

Table 2 Genetic similarity of 6 samples

樣本12345611.000000020.80769231.000000030.83581400.84729061.000000040.83853660.83974090.83000001.000000050.82949310.92682930.85849060.83168321.000000060.82352940.78468900.84259260.79611650.81651381.0000000

由聚類圖可以清晰地看到，當以相似系數0.846(劃線處)劃分時，6個茶樹樣本在樹狀圖上聚為1，2和3等3個類群，其中1類群有當地群體種(鳩坑)和迎霜2個品種；2類群包括嘉茗1號(烏牛早)和聚在一起的2個麗早香樣本，說明2個麗早香樣本在基因型上沒有差異，與嘉茗1號(烏牛早)的親緣關系相對較近；3類群為龍井43，單獨聚為一類群，表明該品種與其他5個樣本有較大的遺傳距離，親源關系較遠。

3 討論

采用改進的CTAB法提取了6個樣本的總DNA，進行了ISSR-PCR擴增，共有10對引物表現良好的多態性，采用其中4對引物能有效地將麗早香與其他作為對照的4個品種區別開來。根據擴增結果數據，進行了遺傳距離、遺傳一致度和相似系數計算，并依據相似系數進行了聚類分析。所有結果具有良好的一致性，麗早香與嘉茗1號(烏牛早)的親緣關系最為接近，與龍井43的親緣關系相對最遠，與迎霜和當地群體種(鳩坑)的親緣關系介于兩者之間。

[1] 陳志輝，單睿陽，林鄭和，等.利用SSR標記分析福建省選育福云半同胞系茶樹品種遺傳多樣性[J].茶葉學報，2015，56(4)：238-243.

[2] 王讓劍，楊軍，孔祥瑞，等.福建15個茶樹品種SSR遺傳差異分析與指紋圖譜建立[J].福建農業學報，2014(10):970-975.

[3] 劉本英，王平盛，季鵬章，等.云南特有茶組植物遺傳多樣性的ISSR研究[J].云南農業大學學報，2008，23(3): 302-308.

[4] 劉本英，成浩.分子指紋圖譜技術及其在茶樹品種資源中的應用[J].茶葉，2007，33(4)：198-202.

[5] 姚明哲，陳亮，王新超，等.我國茶樹無性系品種遺傳多樣性和親緣關系的ISSR分析[J].作物學報，2007，33(4):598-604.

[6] 陳亮，楊亞軍，虞富蓮.應用RAPD標記進行茶樹優異種質遺傳多態性、親緣關系分析與分子鑒別[J].分子植物育種，2004，2(3)：385-390.

[7] 陳海軍，趙東，劉祖生.浙江部分茶樹良種的RAPD分子鑒定[J].茶葉，2002， 28(4):197-198.

[8] 劉本英，孫雪梅，汪云剛，等.綠茶DNA提取方法及分子鑒定的初步研究[J].中國農學通報，2010，26(3):37-41.

(責任編輯 張 韻)

Analysis of genetic characteristics in tea line Lizaoxiang based on ISSR markers

PAN Jian-yi1， CHENG Hao2，*， WANG Li-yuan2， MA Jun-hui1

(1.CropWorkstationofAgriculturalBureauofLishui，Lishui323000，China; 2.TeaResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences，NationalCenterforTeaImprovement，Hangzhou310008，China)

Lizaoxiang is a tea line bred in Lishui City， Zhejiang Province， whose genetic characteristics and diversity with other tea cultivars were the important basis for the examination of new varieties. The local major tea cultivars such as Jiaming No.1(Wuniuzao)， Yingshuang， Longjing 43 and Jiukeng were selected as experimental materials， and the total DNA of 6 materials including the above four cultivars and Lizaoxiang(mountain land type and field land type)were extracted using improved CTAB method and the genetic diversity and relationship of Lizaoxiang were analyzed using inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. The results indicated that Lizaoxiang is a stable tea line without variation in DNA profiles in different cultivation environment. Phylogenetic relationships revealed that Lizaoxiang was closest to Jiaming No.1 (Wuniuzao) but farthest from Longjing 43， while Yingshuang and Jiukeng were in between.

Lizaoxiang; ISSR; genetic diversity; genetic relationship

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.15

2016-03-25

浙江省茶產業重點科技創新團隊項目(2011R50024)；麗水市優質特早紅綠兼制型茶樹新品種選育研究項目(2014XPZ11)

潘建義(1968—)，男，浙江溫州人，碩士，高級農藝師，從事茶葉技術推廣及茶樹品種研究。E-mail：pjy369@126.com

*通信作者，成浩，E-mail：chenghao@mail.tricaas.com

S571.1

A

1004-1524(2016)06-0999-04

潘建義，成浩，王麗鴛，等. 基于ISSR分子標記的茶樹品系麗早香遺傳特性分析[J]. 浙江農業學報，2016，28(6)： 999-1002.