菌酶共降解棉秸稈的工藝研究

侯敏，包慧芳，王寧，詹發強，楊蓉，龍宣杞，崔衛東

(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

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菌酶共降解棉秸稈的工藝研究

侯敏，包慧芳，王寧，詹發強，楊蓉，龍宣杞，崔衛東

(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

【目的】研究菌酶共降解棉秸稈工藝，為菌酶混合棉秸稈固體發酵的研究提供相應的工藝參數和理論依據。【方法】根據羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活確定最佳混菌組，采用正交試驗，研究不同混菌組、酶制劑、含水量對NDF含量、ADF含量、纖維素含量、纖維素降解率的影響，并且通過感官評價、pH值及干物質含量確定發酵棉稈品質。【結果】發酵最優條件為A1B2C2，即混菌組為Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1，酶活為15 000 U/g，加水量為50%。最優發酵條件下，NDF含量降低4.61%，ADF含量降低8.01%，纖維素含量降低10.74%，纖維素降解率達25.62%，pH值為4.21，干物質含量為54.2%，棉稈品質為優等。【結論】菌酶混合發酵棉秸稈提高棉稈品質的最佳條件。

棉稈；混菌；酶；固體發酵；棉稈品質

0 引 言

【研究意義】新疆是我國畜牧業主產區之一[1]，飼草料極為短缺，年缺口超過1 300×104t，嚴重制約畜牧業發展。新疆棉花種植面積約占全國的1/3，棉稈資源相當豐富，年產量達1 000×104t以上。新疆棉花秸稈中粗蛋白的含量為6.5%，比玉米秸稈、稻草和小麥秸稈的粗蛋白含量都要高[2]。因此，棉花秸稈具備制作優質飼草料的基礎。纖維素是棉稈的主要成分，與半纖維素、木質素通過分子間氫鍵形成一種復雜的原纖維結構[3]，降低棉稈中纖維素是解決棉秸稈飼料化的重中之重。【前人研究進展】目前，秸稈預處理方法主要包括生物法、物理法、化學法、物理化學法[4]。廣泛地開展了降解纖維素微生物菌株的研究[5-6]，并且利用纖維素酶制劑提高青貯飼料的營養價值[7-9]。趙政等[10]利用乳酸菌制劑和纖維素酶制劑的添加可以使青貯稻草飼料品質得到明顯改善；在玉米秸稈青貯過程中添加乳酸菌和纖維素酶，可有效降低青貯飼料腐敗率、改善和提高青貯飼料的品質及營養價值[11]；乳酸菌和纖維素酶的共同作用可以使玉米秸稈青貯飼料中NDF，ADF分別降低10%和7%[12]。【本研究切入點】近年來，運用微生物發酵處理棉稈，主要應用于生物肥料，并且利用菌酶混合發酵棉稈飼料的研究還未報道。研究菌酶共降解棉秸桿工藝，確立菌酶混合發酵棉秸稈提高品質的最佳條件。【擬解決的關鍵問題】研究纖維素酶和乳酸菌、芽孢桿菌對棉秸稈飼料品質的影響，為菌酶混合制劑在棉稈飼料中的研究和應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉稈

新疆中收農牧機械公司提供，棉稈處理成1～2 cm片段。

1.1.2 菌種

LP+為植物乳酸菌(lactobacillusplantarum)，TH14為干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)，295為布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)，WS-6為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，BS-2為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

1.1.3 酸性纖維素酶

購于山東蘇柯漢生物工程股份有限公司，酶活≥10 000 U/g；購于山東蘇柯漢生物工程股份有限公司，酶活≥15 000 U/g；日本國立畜產草地研究所提供，酶活≥20 000 U/g；酶活定義：1個酶活力單位是指在特定條件(25℃，其它為最適條件)下，在1 min內能轉化1 μmol微摩爾底物的酶量，或是轉化底物中1 μmol的有關基團的酶量。

1.1.4 培養基

LB培養基：蛋白棟 10 g、酵母粉 5 g、氯化鈉10 g、水 1 000 mL、pH 7.0。

MRS培養基：蛋白胨 10.0 g 、牛肉浸取物 10.0 g、酵母提取液 5.0 g、 葡萄糖 5.0 g、乙酸鈉 5.0 g、檸檬酸二銨 2.0 g、吐溫 80 1.0 g、磷酸氫二鉀 2.0 g、 七水硫酸鎂 0.2 g、七水硫酸錳 0.05 g、碳酸鈣 20.0 g、瓊脂 20.0 g、蒸餾水 1.0 L，pH6.8。

復篩培養基：硝酸鈉 0.5 g、濾紙(需預處理)5.0 g、氯化鉀 0.5 g、氯化鈣0.5 mg、磷酸氫二鉀 1.0 g、硫酸銅 5.0 mg、七水硫酸亞鐵 5.0 mg、七水硫酸鎂 0.5 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 6.0，在121℃、101 kpa下滅菌20 min。

濾紙的預處理方法：將新華1號濾紙用1%的醋酸溶液里浸泡24 h除去淀粉；用碘液檢驗淀粉后，再用2%的碳酸氫鈉溶液洗至中性，然后曬干備用。

1.2 方 法

1.2.1 液體種子的制備

芽孢桿菌經斜面活化后刮取一環接入 200 mL 液體 LB 培養基，在 30℃，120 r/min 條件下搖瓶培養 12 h，制成種子液；乳酸菌經斜面活化后刮取一環接入 200 mL 液體 MRS培養基，在 30 ℃，120 r/min 條件下搖瓶培養18 h，制成種子液。

1.2.2 混菌組的確定

以1%的接種量接種于纖維素分解菌復篩液體培養基，35℃、120 r/min下搖床培養16 d后測定羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活。Lp+、TH14、295、WS-6和BS-2五種菌的混合配比實驗設計。表1

表1 混菌混合配比
Table 1 The design of mix strain rate

混菌組MixedBacteriaGroupLp+TH14295WS-6BS-2①111--②11-1-③11--1④1111-⑤111-1⑥11-11

1.2.3 正交試驗設計

根據實際發酵確定關鍵因素，不同酶活、不同含水量、不同混菌組進行正交試驗，1%的菌液添加量，60 d固體瓶裝發酵實驗，研究酶制劑、含水量及混菌對棉稈中纖維素降解率的影響。選用3因素3水平L9(33) 正交表試驗，進一步優化，采用正交軟件助手對正交試驗結果進行方差分析。其中，混菌組根據確定好的配比分別為組、組、組；酶制劑酶活分別為10 000、15 000和20 000 U/g；含水量分別為40%、50%、60%。每個處理3次重復。對照組為未處理棉稈。表2

表2 正交試驗因素水平
Table 2 The orthogonal experiment factor levels

水平LevelA混菌組MixedBacteriaGroupB酶活(U/g)EnzymeActivityC含水量(%)Moisture1?10000402?15000503?2000060

1.2.4 測定項目

1.2.4.1 棉稈發酵飼料化學成分含量測定含量測定

發酵棉桿中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素含量采用范式(Van Soest)纖維測定法[13]。

1.2.4.2 pH的測定

取 5.0 g鮮樣品，加入45.0 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌1 min后使用酸度計立刻測定pH值。

1.2.4.3 干物質的測定

稱取50.0 g樣品，放置于105℃的烘箱中3 h左右烘干至恒重，冷卻后稱重。

1.2.4.4 棉稈固體發酵評價

感官評價按照德國農業協會[14](DLG)感官評分標準對氣味、結構、顏色、總分等級進行評定。

2 結果與分析

2.1 混菌組確定的

研究表明，六組混菌：①Lp+∶TH14∶295=1∶1∶1、②Lp+∶TH14∶WS-6=1∶1∶1、③Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1、④Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1、⑤Lp+∶TH14∶295∶WS-6=1∶1∶1∶1、⑥ Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1，1%的接種量、35℃、120 r/min下搖床培養16 d后測定羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活。其中③Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1濾紙酶活19.654 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活20.785 U/L，酶活在各組中最高；另外，⑤Lp+∶TH14∶295∶WS-6=1∶1∶1∶1濾紙酶活16.443 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活18.524 U/L；⑥ Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1濾紙酶活18.741 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活19.953 U/L。表3

2.2 正交優化試驗

根據不同混菌組的羧甲基纖維素酶活、濾紙酶活的研究表明，確定三組混菌組：組①：Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1、組②：Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1、組③：Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1；酶制劑酶活分別為10 000、15 000、20 000 U/g；含水量分別為40%、50%、60%。設計三因素三水平正交實驗，結果表明，極差列中混菌組因素的極差值最大，不同的混菌組對纖維素降解率的影響最大，其次是酶活、含水量。發酵最優條件為A1B2C2，即混菌組為Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1，酶活為15 000 U/g，加水量為50%。對照未處理的棉稈NDF含量為63.43%，ADF含量為58.12%，纖維素含量為41.92%。經過固體發酵，NDF含量降低3.44%～4.61%，ADF含量降低4.14%～8.01%，纖維素含量降低4.72%～10.74%。最優發酵條件下，纖維素降解率達25.62%。表4

表3 混菌混合配比結果
Table 3 The results of Mixed fungus mix ratio test

實驗組ExperimentalGroup濾紙酶活(U/L)FilterPaperEnzymeActivity羧甲基纖維素鈉酶活(U/L)SodiumCarboxymethylCelluloseEnzymeActivity①1141314524②1611816706③1965420785④1583217155⑤1644318524⑥1874119953

表4 發酵培養基優化正交試驗
Table 4 The results from the orthogonal test for optimized composition of the ferment medium

實驗組ExperimEntalGroupA混菌組MixedBacteriaGroupB酶活(U/g)EnzymeActivityC含水量(%)MoistureNDF(%)ADF(%)Cellulose(%)纖維素降解率(%)CelluloseDegradationRate1?200004059095011315924642?150005059075024311825623?100006059005111318224094?200004059225134333020565?150005058825074330221236?100006059065121353515677?200004058965293354015568?150005058885259342318349?10000605990539837201126K1247820251955----K2191521731915----K3150517012029----R973472115----

2.3 棉稈發酵飼料的感官評定、pH及干物質的測定

研究表明，經過微生物發酵處理的棉稈在氣味上評分11～13、結構上評分均為4、顏色上評分1～2、總分16～20，等級均為優等。對照CK，氣味上評分8、結構上評分均為4、顏色上評分1、總分13，等級尚好。表5

表5 棉稈發酵飼料感官評分
Table 5 The standards of Cotton fermented feed sensory score

樣品TheSample氣味Smell結構Structure顏色Color總分TotalScore等級Grade1134217優等2144220優等3134219優等4114217優等5114217優等6114116優等7114116優等8114116優等9114116優等CK84113尚好

棉稈微貯處理后的pH值表明。對照CK未處理棉桿pH值最高，為4.97；經過微生物發酵的棉桿處理均比對照低，pH在4.21～4.56；其中，實驗組2的pH值最低，為4.21。圖1

圖1 棉桿發酵飼料pH值
Fig.1 pH value of fermented cotton feed

研究表明，經微貯后的棉稈發酵飼料干物質含量測定結果顯示。對照CK未處理棉桿干物質含量最低，為12.2%；經過微生物發酵的棉桿處理均比對照高，干物質含量在26.4%～54.2%；其中，實驗組2的干物質含量最高，為54.2%。圖2

圖2 棉桿發酵飼料干物質含量測定結果
Fig.2 Dry matter content determination results of fermented cotton feed

3 討 論

3.1 作物青貯時接種同型乳酸菌(主要為糞鏈球菌、啤酒片球菌、植物乳桿菌、干酷乳桿菌)，可以迅速增加農作物表面的乳酸菌數目，使乳酸發酵占主導地位，從而達到降低pH值，抑制有害微生物的活動，保存和提高飼料營養價值的目的[12]。微生物固體發酵過程中加入芽孢桿菌等，其本身就是益生菌，有利于改善動物胃腸道的微生態環境，減少抗生素的應用和疾病的發生[15-16]。加入酶制劑能夠降低粗飼料中的纖維素、半纖維素、淀粉等，解決秸稈類飼料中粗纖維含量過高的問題，從而促進乳酸發酵，提高飼料利用率。實驗采用芽孢桿菌、植物乳酸菌及酸性纖維素酶的菌酶復合制劑發酵棉稈，可有效降低棉稈飼料腐敗率、改善和提高青貯飼料的品質。

3.2 對于青貯飼料，對其發酵品質的評估很重要,這包括測定青貯飼料的pH值、各種揮發性脂肪酸、乳酸的含量、青貯的損失、氨態氮/總氮、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、木質素、可溶性碳水化合物(WSC)的含量[17]。原料適宜的水分是保證青貯過程中乳酸菌正常活動的重要條件之一，水分過多，容易腐爛，滲出液多，養分損失大；水分過低，會直接抑制微生物發酵，且由于空氣難以排凈，易引起霉變[18]。pH是評價微貯和青貯飼料品質最簡單且最重要的指標，

pH值越低，酸度越大，則說明飼料得到了很好的保存[19]，品質優良的青貯飼料pH為3.8～4.5[12]。實驗考察不同混菌組、酶制劑、含水量對NDF含量、ADF含量、纖維素含量、纖維素降解率的影響，并且通過感官評價、pH值及干物質含量確定發酵棉稈品質。

4 結 論

4.1 設計六組混菌，確定最優化酶活產量。其中，③ Lp+∶TH14∶BS-2=1∶1∶1濾紙酶活19.654 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活20.785 U/L，酶活在各組中最高；另外，⑤Lp+∶TH14∶295∶WS-6=1∶1∶1∶1濾紙酶活16.443 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活18.524 U/L；⑥ Lp+∶TH14∶BS-2∶WS-6=1∶1∶1∶1濾紙酶活18.741 U/L、羧甲基纖維素鈉酶活19.953 U/L。根據測定羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活結果，挑選③、⑤、⑥三組產酶活較高的混菌組進行下一步正交試驗。

4.2 根據實際應用，設計不同酶活、不同含水量、不同混菌組三因素三水平正交試驗，以NDF含量、ADF含量、纖維素含量、纖維素降解率為指標，確定最佳發酵條件。發酵最優條件為A1B2C2，即混菌組為Lp+∶TH14∶295∶BS-2=1∶1∶1∶1，酶活為15 000 U/g，加水量為50%。最優發酵條件下，NDF含量降低4.61%，ADF含量降低8.01%，纖維素含量降低10.74%。纖維素降解率達25.62%。

4.3 對發酵棉稈進行感官評定，并且測定pH值及干物質含量。經過微生物發酵處理的棉稈在氣味上評分11～13、結構上評分均為4、顏色上評分1～2、總分16～20，等級均為優等；pH值在4.21～4.56；其中，實驗組2的pH值最低，為4.21；干物質含量在26.4%～54.2%；其中，實驗組2的干物質含量最高，為54.2%。

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Fund project:Xinjiang Uygur Autonomous Region Fund for Young Scholars "Screening and Breeding of Highly-Effected Degrading Lignocellulose Strains and Degradation Effect Research" (2015211B019)；the Basic Science and Technology Research Support Funds of Non-profit Research Institutions of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Microbial Treatment Technology of Cotton Stalks" (KY2014028)

Technology for Co-degradation of Cotton Stalk by Microorganism and Enzyme

HOU Min, BAO Hui-fang, WANG Ning, ZHANG Fa-qiang, YANG Rong,LONG Xuan-qi, CUI Wei-dong

(Research Institute of Applied Microbiology / Xinjiang Academy of Agricultural Sciences / Xinjiang LaboratoryofSpecialEnvironmentalMicrobiology,Urumqi830091,China)

【Objective】 The co-degradation technology of cotton stalk by microorganism and enzyme will be studied.【Method】ccording to the carboxymethyl cellulose enzyme activity and filter paper enzyme activity, the best mixed bacterium group was determined and by orthogonal experiment, the different mixed bacteria group, enzyme preparation, contents of moisture content of NDF, ADF, cellulose, cellulose degradation rate and the effect were observed and through the sensory evaluation, pH value and dry matter content, the fermentation quality of cotton was determined.【Result】The results showed that the fermentation conditions was as follows (g/L): mixed bacterium group for Lp+:TH14: 295: BS-2=1:1:1:1, the enzyme activity of 15 000 U/g, water content of 50%. Under the optimal fermentation conditions, the NDF content was reduced by 4.61%, ADF content was reduced by 8.01%, cellulose content was reduced by 10.74%, cellulose degradation rate was 25.62%, and the pH value was 4.21, dry matter content was 54.2%, the cotton quality was superior.【Conclusion】This experiment determined the best conditions to increase the quality of cotton, and the results can be used as technical parameters and theoretic basis for decreasing the degradation rate with mixture microorganism and enzyme strain on cotton stalks.

cotton; mixed bacteria; enzyme; solid-state fermentation; the quality of cotton

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.014

2016-04-25

新疆維吾爾自治區青年基金項目“木質纖維素降解菌株選育及混菌發酵在棉稈飼料中降解效果研究”(2015211B019)；自治區公益性科研院所基本科研業務經費資助項目“棉秸稈飼料化微生物處理技術研究”(KY2014028)

侯敏(1983-)，女，新疆人，助理研究員，研究方向為農業微生物及發酵工程，(E-mail)hmde_092@ 163.com

崔衛東(1969-)，男，新疆人，研究員，研究方向為發酵工程，(E-mail)cuwedo@163.com

S182

A

1001-4330(2016)08-1467-07