不同居群大賴草醇溶蛋白分析

薛曉東，代培紅，吾買爾夏提·塔漢，周桂玲

(1.新疆農業大學草業與環境科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052 )

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不同居群大賴草醇溶蛋白分析

薛曉東1，代培紅2，吾買爾夏提·塔漢1，周桂玲1

(1.新疆農業大學草業與環境科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052 )

【目的】研究新疆大賴草[Leymusracemosus(Lam.) Tzvel]不同居群種子醇溶蛋白，探討大賴草種質在居群間和居群內的差異及遺傳多樣性。【方法】采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)技術對采集到的5個居群間及居群內大賴草種子醇溶蛋白進行遺傳多樣性研究。【結果】5份居群間材料共分離出19條帶紋，只有2條是共有帶，多態率為89.47%。居群內共分離出17條譜帶，7條為共同帶，多態率為58.82%，小于居群間；材料間的Shannon指數范圍是0.346 7～0.400 0，平均值為0.372 7。Nei-Li遺傳相似系數(GS)的變異范圍為1.583 7～1.738 5，平均值1.659 4。相似系數GS值變異范圍是0.429～0.733，平均為0.554。進一步聚類分析表明，在GS值為0.62的水平上供試材料可聚成3個大類，生境相似的居群聚為一類，表現出一定的分布規律。【結論】大賴草種子遺傳多樣性在居群間差異明顯，而居群內不明顯。醇溶蛋白凝膠電泳可以作為指紋圖譜，用于研究同一物種不同居群間及居群內的差異是可行的。

大賴草；不同居群；醇溶蛋白；遺傳多樣性；聚類分析

0 引 言

【研究意義】麥醇溶蛋白是麥類植物種子胚乳中的主要貯藏蛋白，其電泳圖譜常被用作品種、種質及品質鑒定的標準[1-3]。醇溶蛋白因極其復雜的多態性和不受一般環境條件影響的遺傳穩定性，被稱為品種的生化指紋。大賴草[Leymusracemosus(Lam.) Tzvel]為禾本科小麥族植物。主要分布在新疆準噶爾盆地古爾班通古特沙漠沿額爾齊斯河兩岸的沙丘上及俄羅斯東南部的一些沙漠中[4-6]。大賴草因其地上、地下生殖構件強，所以對沙丘的固定起著重要的作用。同時，它穗大、多花、稈強，并且具有抗干旱、寒冷、鹽堿和多種病蟲害等特點，使得國內外不少學者在小麥育種及轉基因工作中對大賴草的優良種質進行了大量的應用[7-9]。【前人研究進展】目前，醇溶蛋白電泳分析應用廣泛，研究發現醇溶蛋白在麥類近緣屬植物的種間、種內不同來源材料間也存在著明顯差異。采用此方法對沙生冰草[10]、垂穗披堿草[11]、節節麥[12]和大麥[13]等植物的遺傳多樣性及起源與進化的研究均有報道。【本研究切入點】采用醇溶蛋白技術對大賴草的遺傳多樣性研究還未見報道。研究分析新疆大賴草不同居群種子醇溶蛋白，以及其居群間和居群內的差異和多樣性。【擬解決的關鍵問題】采用麥醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，對分布于新疆阿勒泰地區的大賴草進行居群間和居群內的分析，研究大賴草種質在居群間和居群內的差異及遺傳多樣性，為大賴草種質資源的開發、利用及保護提供重要的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用大賴草均分布于新疆阿勒泰地區額爾齊斯河沿岸的沙丘上，共采集了5個居群，它們是：福海縣加勒合孜胡德克村(P1)，哈巴河縣185團拜鐵祿村(P2)，布爾津縣喀臘幸格勒村(P3)，哈巴河縣阿克多尕拉克村(P4)，阿勒泰市喀拉干德闊拉村(P5)。列出材料的編號、采集地及生境等。表1

表1 供試材料采集地、編號和生境Table 1 The distribution region,serial number,habitat

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

從以上5個居群分別采集20個相互獨立(每株間隔最少15 m)成熟飽滿的果穗，然后每個居群從其中隨機取5個果穗上的種子進行居群間實驗，每穗隨機取兩粒種子。居群內研究取樣：選擇居群4(面積大，植株多)，取5個結實的果穗，每穗之間間距至少15～20 m，尤其避免采集到克隆植株。將所取種子研碎后，采用ISTA(1986)頒布的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acid polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱A-PAGE)(pH 3.1)標準程序(稍加改進)電泳分析醇溶蛋白[1,2,14]。電泳儀器為北京六一儀器廠的DYY-12型電源，電泳槽為DYCZ-24EN。具體方法參照魏秀華等[15]。

1.2.2 數據處理

參照小麥醇溶蛋白分別按遷移距離和分子量大小劃分的α、β、γ、ω四個區并計算大賴草醇溶蛋白的相對遷移率。數據處理中對醇溶蛋白譜帶采用“0-1”數據轉換，有帶記為1，無帶記為0，獲得數據距陣。對不同居群間的數據聚類分析利用NTSYS-pc軟件按基于Nei-Li遺傳相似系數(GS，即Dice系數)的不加權成對算術平均法(UPAMA)進行。按公式 GSij=2Nij/(Ni+Nj)計算(其中，Nij為材料i和j共有條帶數目，Ni、Nj分別為材料i、j的條帶數目)

1.2.3 計算

參照車永和等[16]及馬嘯等[11]的方法計算Shannon-weaver指數H和Simpson指數D(即Nei氏基因多樣性指數)來估計各種質及其生態地理類群間的遺傳多樣性。

2 結果與分析

2.1 居群間醇溶蛋白分析

2.1.1 供試材料醇溶蛋白多態性

5個居群的種子醇溶蛋白分別用大麥和小麥兩種提取劑[17]進行提取。多次試驗表明，大麥提取液能更充分地提取出大賴草種子醇溶蛋白。因此，利用該提取液實驗所得數據進行分析。結果表明，5個居群的醇溶蛋白共分離出19條帶紋，每份材料可分離出6～15條帶紋。按遷移率由大到小可分為α、β、γ、ω共4個區，帶紋集中分布于ω區(6條)，β區也較多(5條)，α、γ區較少(各4條)。19條帶紋中，僅2條是所有材料共有的，其中β和ω區各有1條，其多態率為89.47%，而α、γ區沒有一條帶紋是所有居群共有的，其多態率均為100%。4個區的平均帶紋多態率為90.83%，平均Shannon指數為0.372 7，平均Simpson指數為1.659 4 。各電泳分區的Shannon指數H和Simpson指數D所揭示的遺傳多樣性的變化趨勢基本一致。圖1，表3

P：表示用大麥提取液，p：表示用小麥提取液

Note：P: extracting alcohol soluble protein with barley extract，p: extracting alcohol soluble protein with wheat extract

圖1 5個居群大賴草材料的醇溶蛋白電泳圖譜

Fig.1 Gliadin patterns of 5Leymusracemosus(Lam.) Tzvel populations A-PAGE

2.1.2 相似系數

對醇溶蛋白電泳結果采用Nei-Li相似系數(GS)的計算方法，得到供試材料相似系數矩陣。5個居群大賴草的種質GS值變異范圍為0.429～0.733，平均 0.554，變幅為0.304，由相似系數矩陣可以看出，P1與P5之間遺傳相似系數最小，其遺傳距離最大，表明它們相互地區間材料的親緣關系最遠。而P2與P4的兩份種質之間的遺傳相似系數最大，其遺傳距離小，表明這兩份材料親緣關系最近。以上結果進一步表明，5個居群之間差異明顯，具有較為豐富的醇溶蛋白遺傳多樣性。表4

表2 5個居群大賴草材料的電泳酶帶數及分布Table 2 Distribution and number of gliadin bands of 5 Leymus racemosus (Lam.)Tzvel populations

注:“—”代表酶帶存在位置

Note: “—”Indicates the position of the band

表3 5個居群大賴草的醇溶蛋白多態性Table 3 The gliadin genetic polymorphism of 5 Leymus racemosus (Lam.) Tzvel populations

注:*：α、β、γ、ω 4個區H值和D值的平均數

Note:*：Means the average numbers of Shannon index(H)and Simpson index(D) for four electrophoretic zones

表4 大賴草5個居群間遺傳相似系數Table 4 Genetic similarity coefficients of 5 Leymus racemosus (Lam.) Tzvel populations

對5個居群大賴草醇溶蛋白遺傳相似系數按UPGMA法進行聚類分析。結果顯示，當GS=0.62水平時，5個居群可以劃分為3大類，P2與P4聚為一類；P1、P3聚為第二類；P5單獨為一類。結合5個居群生境可以看出，根據供試材料的遺傳相似系數得出的聚類分析結果與其地理來源有一定相關性，具有相同地理來源的材料趨向于聚在一起。圖2

圖2 5個居群大賴草醇溶蛋白數據聚類Fig.2 Dendrogram of 5 Leymus racemosus (Lam.) Tzvel populations gliadin data using Nei-Li，s genetic similarity coefficients

2.2 居群內醇溶蛋白

實驗選用大麥提取液進行操作。以居群P4為研究對象，進行了居群內醇溶蛋白電泳分析，結果共得到17條譜帶，可以看到，z1 所得到的條帶最為清晰，共15條。圖3

圖3 大賴草居群內醇溶蛋白電泳圖譜Fig.3 Gliadin patterns of Leymus racemosus(Lam.) Tzvel within population A-PAGE

另外，z2、z3及z5上部有1～2條弱帶，其余材料沒有，除此之外，各材料間強帶幾乎完全相同，共有的條帶為7條，多態率為58.82%。

3 討 論

報道顯示，醇溶蛋白具有高度異質性和復雜性，使用其研究方法對于評價不同物種間以及同種不同居群間的遺傳多樣性具有一定的可行性[18-19]。

3.1 居群間

研究通過電泳分離出6～15條遷移率不同的醇溶蛋白帶紋，只有2條是共同帶，多態率為89.47%，多態性比較高。不同居群間的材料醇溶蛋白帶型表現出較大的相似性，α和γ區的帶紋較少，且沒有一條帶紋是所有材料共有的，β、ω區帶紋多態性最大，分別各有一條共有條帶，與馬嘯[11]對垂穗披堿草的分析類似。由相似系數矩陣可以看出，P1與P5之間遺傳距離最大，說明它們之間親緣關系最遠。P2與P4之間遺傳距離小，表明它們之間的親緣關系最近。但是從實際距離上看，P1與P5之間相隔40 km左右，而P2與P4之間相隔有60多km之多，那么P2、P4兩個居群的遺傳距離大于P1與P5間的遺傳距離，可以解釋為環境是造成其差異的主要因素。P1與P5居群間雖然距離較近，但中間相隔了2個縣級城市與一個烏倫古湖，使其成為一個屏障，阻隔了兩地的基因流動；而P2與P4雖然距離較遠，但二者之間是連綿的沙漠和部分農田。基因交流通暢、生境相同。

嚴學兵等[20]通過分子技術研究披堿草屬植物遺傳分化和親緣關系的地理因素分析時得出總遺傳變異的8.9%與地理距離有關，14%是由生境造成的，肯定了生境條件對披堿草屬植物遺傳變異的影響。馬嘯等[11]對野生垂穗披堿草種質的醇溶蛋白遺傳多樣性分析表明，醇溶蛋白圖譜類型與材料的生態地理環境具有一定的相關性。

3.2 居群內

通過大賴草居群內凝膠電泳得到的電泳圖與前人[21]的結果進行對比可以看出其研究結果相似，即大賴草居群內各試驗材料種子蛋白電泳所獲得的條帶數量和位置上都比較一致，尤其是強帶幾乎完全相同，個別材料的差異僅表現在弱帶上，與魏秀華等[15]對鵝觀草屬居群內的分析類似。但因凝膠的速度及濃度稍微不均導致各試驗材料所得條帶并不是一一對應，即遷移率大小一樣的蛋白，各試驗材料橫向帶紋在圖譜上的位置并不是顯示在同一個水平上，但這并不影響分析，資料記載[21]也有類似的情況。唐慧慧等[13]對“中國野生大麥醇溶蛋白遺傳多態性研究”也發現，地理環境相似地區的材料有著相似的醇溶蛋白圖譜類型。可以看出同一居群內種子醇溶蛋白的差異不是很大。

3.3 居群間與居群內對比

嚴學兵等[22]采用等位酶分析法研究了老芒麥等9個披堿草屬物種40個居群的遺傳多樣性，結果發現每個物種居群內的遺傳多樣性遠低于居群間，屬級水平上的遺傳多樣性主要存在于種間和種內居群間，而且各居群的遺傳距離與海拔和經緯度相關性顯著。研究也發現，大賴草的居群間條帶多態性(89.47%)大于居群內(58.82%)，說明了居群內的遺傳多樣性低于居群間，環境上的差異是不同居群間遺傳多樣性產生的主要原因。Nevo[23]分別觀察了在大、小地理尺度下自然居群的蛋白質變異，發現在大尺度地理條件下，由于生境不同阻礙了基因漂移，從而造成較大的遺傳差異。

4 結 論

研究對大賴草5個居群間和居群內進行醇溶蛋白電泳圖譜分析，結果顯示5個居群之間條帶差異明顯，居群內不明顯，說明醇溶蛋白凝膠電泳可以作為指紋圖譜，用于研究同一物種不同居群間及居群內的差異是可行的，同時也表明，大賴草居群間及居群內都發生了遺傳變異，居群間大于居群內。

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Fund project:Supported by National Natural Science Foundation of China(31160134)

Study on Gliadin of Leymus racemosus (Lam.)Tzvel of Different Populations

XUE Xiao-dong1, DAI Pei-hong2, Wumaierxiati Tahan1, ZHOU Gui-ling1

(1. College of Pratacultural and Environmental Sciences,2.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 In order to investigate the differences and genetic diversity ofLeymusracemosusgermplasm among and within the populations，the project aims to study the seed gliadin of XinjiangLeymusracemosusbetween different populations.【Method】The genetic diversity of 5Leymusracemosuspopulations' seed gliadin were analyzed by using acid polyacrylamide gel electrophoresis(A-PAGE).【Result】(1)19 gliadin bands were separated by electrophoresis between 5 populations of them, 17 bands had polymorphisms and the polymorphic rate was 89.47%. 17 bands were isolated from populations, 10 bands had polymorphisms and the polymorphic rate was 58.82%, the polymorphism rate within populations were less than among the populations.(2)The variation's range of Shannon index between materials was 0.346,7-0.400,0, average value was 0.372,7. The variation's range of Nei-Li genetic similarity coefficient (GS) was 1.583,7-1.738,5, average value of 1.659,4.The variation's range of genetic similarity coefficient (GS) was 0.429-0.733，average value of 0.554. Further clustering analysis showed that the test materials could be clustered into 3 categories when the GS value was 0.62, and habitat similar populations could be clustered together, which also showed that it was a certain distribution between different populations.【Conclusion】The electrophoresis of the seed gliadin showed that the genetic diversity among populations was significantly different and not obvious within populations. It was explained that the electrophoresis of seed gliadin could be used as a fingerprint, and was feasible when it was used to study the differences between and within populations.

Leymusracemosus(Lam.) Tzvel; different populations; gliadin; genetic diversity; cluster analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.019

2016-03-21

國家自然科學基金項目(31160134)

薛曉東(1983-)，男，山西大同人，碩士研究生，研究方向為植物資源學，(E-mail)414273009@qq.com

周桂玲(1957-)，女，新疆烏魯木齊人，教授，碩士生導師，研究方向為植物學，(E-mail)1820944856@qq.com

S184

A

1001-4330(2016)08-1500-07