利用正交試驗優化葡萄酒酵母凍干保護劑

王鴻磊+王紅艷+劉彤

摘要：空冷凍干燥是保存微生物材料最有效的方法之一，凍干保護劑對冷凍干燥后微生物的存活率具有重要影響。本研究以煙臺產區優良葡萄酒酵母菌為研究對象，通過單因素實驗和正交試驗設計，研究了脫脂乳粉、蔗糖和抗壞血酸3種物質對葡萄酒酵母凍干存活率的影響，結果表明，3種保護劑的保護效果依次為：蔗糖>脫脂乳粉>抗壞血酸；最佳保護劑的配方為：脫脂奶粉8%+蔗糖12%+抗壞血酸6%，加入優化后的凍干保護劑后，葡萄酒酵母凍干后存活率可達95.3%。

關鍵詞：葡萄酒酵母；冷凍干燥；保護劑；正交優化

葡萄酒是一種營養豐富的低度發酵酒，是僅次于啤酒的第二大酒精飲料，深受人們的喜愛[1]。葡萄酒釀造是一個復雜的生物轉化過程，葡萄酒質量的好壞與酵母菌有著密切的關系[2-4]。在世界著名的葡萄和葡萄酒產區，由于地理位置、氣候、土壤等的不同，形成了各自不同的葡萄風格，各產區的酵母菌也逐漸適應了當地的氣候、土壤和葡萄品種，形成了適于當地葡萄酒釀造的菌系[5]。國外在產地葡萄酒發酵專用酵母篩選上進行了一系列的研究，獲得了一系列適于表現本地葡萄風格的專用酵母發酵劑，使得所釀葡萄酒具有很強的甚至獨一無二的產地特性。然而，我國目前葡萄酒發酵中使用的酵母菌完全依賴進口，這種引進的發酵劑，往往在當地葡萄酒生產上并不能完全表現出其優良性狀，不能完全體現產地葡萄的品質和特色[6]，降低了葡萄酒產品的獨特性和風味的多樣性，造成各地葡萄酒質量和風格的趨同化。因此，我國應加強本土葡萄酒酵母菌發酵劑的研究，以生產具有獨特產地特性的優質葡萄酒。煙臺產區是我國葡萄酒工業的發祥地，是我國最大的葡萄和葡萄酒的生產基地，擁有聞名于世的葡萄酒第七大葡萄海岸[7]，葡萄酒產量約占全國葡萄酒總產量的1/3[8]。煙臺產區的葡萄釀出的葡萄酒具有區別于其他葡萄酒產區獨特的海岸葡萄酒風格。煙臺產區的葡萄園歷史悠久，在葡萄園內形成了穩定的天然酵母區系，蘊含著豐富的天然酵母菌資源。

真空冷凍干燥（簡稱凍干）是制備和保存微生物材料最有效的方法之一[9]。利用此方法生產的發酵劑具有活菌存活率高，接種量小，保存期長等優點[10-15]。本研究以篩選自煙臺葡萄園的優質葡萄酒酵母為研究對象，研究了不同凍干保護劑對葡萄酒酵母的保護效果，并通過正交試驗對葡萄酒酵母凍干保護劑配方進行了優化，為研發適于煙臺產區的優質活性葡萄酒干酵母發酵劑提供技術支持。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：葡萄酒酵母：本實驗室分離保藏。

1.1.2 試劑、培養基：蔗糖、抗壞血酸、脫脂奶粉、馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDA液體培養基）、馬鈴薯葡萄糖固體培養基（PDA固體培養基）

1.1.3 儀器設備：超凈工作臺（上海博訊實業有限公司）、恒溫培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業有限公司）、電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司）、萬分之一分析天平（賽多利斯）、冷凍干燥機（東京理化）、恒溫振蕩器（上海博訊實業有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄酒酵母增殖培養

將葡萄酒酵母接種于PDA培養基斜面上，28℃活化24h，將活化的菌種接入PDA液體培養基中，28℃，180r/min培養48h。

1.2.2 單因素試驗及正交優化試驗

取增殖培養后的培養液4000r/min離心20min，棄上清液，用無菌生理鹽水清洗3遍，補入同體積保護劑，制成懸浮液。

1.2.3 預凍

將均勻混合了保護劑的菌懸液轉入凍干瓶中，在-85℃的低溫條件下預凍12h至樣品完全凍結后取出。

1.2.4 冷凍干燥

將預凍完結的菌懸液置于冷凍干燥機中進行干燥處理，待菌懸液完全成粉末狀時預示冷凍干燥完成。

1.2.5 冷凍存活率計算

利用平板涂布法測定凍干前后酵母菌的活菌數，利用以下公式計算存活率。

1.2.6 數據分析

采用SPSS軟件對數據進行分析，采用OriginPro7.5進行圖形繪制。

2 結果分析

2.1葡萄酒酵母凍干保護劑的單因素試驗

2.1.1 脫脂奶粉濃度菌體存活率的影響

在生理鹽水中加入脫脂奶粉，使脫脂奶粉的終濃度達到4%、6%、8%、10%、12%，凍干后測定酵母存活率，結果如圖1所示。

隨著脫脂奶粉加量的增加，酵母的存活率逐漸上升，脫脂奶粉濃度達到8%，酵母存活率達到最高，之后隨著脫脂奶粉濃度的增加，酵母存活率逐漸降低。

2.1.2蔗糖濃度菌體存活率的影響

在生理鹽水中加入蔗糖，使蔗糖的終濃度達到9%、10%、11%、12%、13%、14%，凍干后測定酵母存活率，結果如圖2所示。

蔗糖對酵母存活率的影響與脫脂奶粉相似，隨著蔗糖濃度的增加，酵母的存活率逐漸上升，蔗糖濃度達到12%時酵母存活率達到最高，之后隨著蔗糖濃度的增加，酵母存活率略有下降。

2.1.3抗壞血酸濃度菌體存活率的影響

在生理鹽水中加入抗壞血酸，使抗壞血酸的終濃度達到4%、6%、8%、10%、12%，凍干后測定酵母存活率，結果如圖3所示。

抗壞血酸濃度達到8g/L時酵母存活率達到最高，之后隨著抗壞血酸濃度的增加，酵母存活率逐漸降低。

2.2 葡萄酒酵母凍干保護劑的正交優化

在單因素的基礎上，為獲得最佳的保護劑配方，采用三因素三水平正交試驗設計對脫脂乳粉、蔗糖和抗壞血酸3個因素進行考察，確定最佳的保護劑組合。各種保護劑水平設計見表1。

按表1的因素水平設計正交試驗，其結果如表2所示。

由表2極差R分析可知，3種保護劑對菌種存活率影響由大到小順序為B>A>C，即蔗糖對酵母存活率影響最大，其次是脫脂乳粉，最后是抗壞血酸。根據極差分析，酵母存活率最高的組合為A2B2C1，由于這個組合不在已做的9次試驗中，所以對其進行了驗證，結果如表3所示。

經過三次重復試驗，葡萄酒酵母菌的存活率平均達到95.3%，均高于表2中的存活率，所以最佳組合為A2B2C1，即最佳凍干保護劑配方為：脫脂奶粉8%+蔗糖12%+抗壞血酸6%。

3 討論

在冷凍干燥技術制備葡萄酒酵母制劑的過程中，冷凍是導致酵母菌死亡的主要原因。凍干保護劑的加入將大大提高酵母菌冷凍干燥后的存活率。試驗證明3種保護劑中蔗糖的保護效果是最好的。由于蔗糖具有多個羥基，可以阻止細胞膜因失水而融合，可與蛋白質形成氫鍵防止蛋白質因凍干而變性，同時蔗糖在溶液中易結合水分子，減緩了晶核的生長過程，所以具有很好的保護細胞的作用。但是單靠蔗糖一種保護劑不能達到最佳的保護效果，本試驗利用三種保護劑的協同作用，得到了高于單一保護劑的酵母存活率，為進一步研制活性干酵母奠定了基礎。

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[7]吳偉洪.煙臺蓬萊成世界第七大葡萄海岸產區.http：//finance.sina.com.cn/o/20050823/1051278369.shtml

[8]煙臺葡萄與葡萄酒局成立 謀劃葡萄產區聯盟.http：//www.chinadaily.com.cn/m/shandong/c/2010-12/21/content_11735650.htm

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