豬藍耳病活疫苗生產工藝探索

趙輝 葛俊偉/東北農業大學動物醫學院

秦立鑫 郭立權/哈藥集團生物疫苗有限公司

豬藍耳病活疫苗生產工藝探索

趙輝 葛俊偉/東北農業大學動物醫學院

秦立鑫 郭立權/哈藥集團生物疫苗有限公司

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又稱“藍耳病”，自2006年的夏秋季節，我國陸續暴發一種以高熱為典型癥狀的綜合癥，給全國養豬業帶來巨大浩劫。2007年1月，確定變異豬藍耳病病毒是豬“高熱病”主要病原，并定名為高致病性豬藍耳病 (Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)。該病是由 HP-PRRS 病毒(HP-PRRSV)引起的一種急性高致病性疫病。該病仔豬發病率可達 100%、死亡率可達50%以上，母豬流產率可達30%以上，育肥豬也可發病死亡是其特征。HP-PRRS同其他病毒性疾病一樣，目前尚沒有較為有效的治療藥物，除按傳統的隔離、消毒、控制人員活動對該病進行控制外，重中之重就是要有安全、穩定、高效的疫苗進行正確的免疫接種。因此, 研制出安全、高效、生產工藝簡單、成本較低而又適應市場需求的高致病性豬藍耳病疫苗成為生產企業努力的方向。

本研究對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（HuN4-F112株）的生產工藝關鍵環節進行探索。從細胞擴大培養時的傳代比例、培養液血清濃度、毒種繁殖時的接毒量、培養液體積、病毒原液收獲時間、半成品原液保存溫度及保存時間等幾方面參數對原液的病毒效價的影響，展開對比試驗，最終確定最佳參數，為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（HuN4-F112株）的大批量生產提供參考，不但要保障疫苗產品的質量，更要大大降低疫苗的生產成本和生產人員的勞動強度。

一、試驗方案

（一）確定Marc-145細胞傳代比率試驗。

將長滿單層的Marc-145細胞棄去營養液，用分散液分散后按1∶2、1∶3、1∶4、1∶5傳代比例傳代，確定生產時最適合的傳代比率。

1∶2傳代：將轉瓶中分散好的Marc-145細胞加入已配制好的營養液，轉瓶中加入2 000 ml培養液，將細胞搖勻后無菌分裝到2個轉瓶中。

1∶3傳代：將轉瓶中分散好的Marc-145細胞加入已配制好的營養液，轉瓶中加入3 000 ml培養液，將細胞搖勻后無菌分裝到3個轉瓶中。

1∶4傳代：將轉瓶中分散好的Marc-145細胞加入已配制好的營養液，轉瓶中加入4 000 ml培養液，將細胞搖勻后無菌分裝到4個轉瓶中。

1∶5傳代：將轉瓶中分散好的Marc-145細胞加入已配制好的營養液，轉瓶中加入5 000 ml培養液，將細胞搖勻后無菌分裝到5個轉瓶中。

將轉瓶置于37℃溫室中進行恒溫培養，觀察細胞貼壁增殖狀況，并做好記錄。

（二）不同接毒量對比試驗

取形成良好單層的Marc-145細胞培養瓶，分別按培養液總量的1%、2%、3%、4%接入毒種，充分吸附后，

加入1%犢牛血清的DMEM培養液1 000 ml（維持液），置37℃培養，每日觀察并記錄CPE，當CPE達到80%時收獲，測定病毒原液的TCID50，綜合考慮后，選出既能保證生產又能降低生產成本的最佳接毒量。

（三）培養液中不同血清含量的比較試驗

取形成良好單層的Marc-145細胞培養瓶，按1%接入毒種，充分緩慢旋轉吸附，然后加入不同含量犢牛血清為1%、2%、3%、4%的培養液，置37℃恒溫旋轉培養，每日觀察記錄CPE，CPE達80 %時，收獲病毒液，分別測定TCID50。

（四）培養液的不同加入量對比試驗

取形成單層的Marc-145細胞培養瓶，每次選擇8瓶細胞生長狀況大致相同的培養瓶，按培養液總量1%接入毒種，加入含1%犢牛血清的DMEM培養液，一組2瓶，各加入800 ml培養液，二組2瓶，各加入1 000 ml培養液，三組2瓶，各加入1 200 ml培養液，四組2瓶，各加入1 400 ml培養液，置37℃恒溫旋轉培養，當CPE達到80%時，收毒，取樣，分別測定含毒原液的TCID50。

（五）不同收獲時間對比試驗

取形成良好單層的Marc-145細胞培養瓶，按培養液的1 %接入毒種，充分緩慢旋轉吸附，然后加入含1%犢牛血清的培養液，分別于CPE達到70%、80%、90%收獲病毒液，并詳細記錄收獲時的培養時間。分別測定TCID50，以便選出最佳收毒時間。

（六）病毒原液不同保存溫度和時長的對比試驗

將收獲的病毒原液，分成8組，使用滅菌西林瓶分裝，濕毒保存，每瓶5ml，每組兩瓶。分別儲存于4℃、-20℃、-40℃、-70℃溫度，保存0 d、5 d、15 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d，比較不同保存溫度及保存時間對病毒液毒價的影響。

二、試驗結果

（一）Marc-145細胞傳代比率的確定

在Marc-145細胞傳代時用胰酶-EDTA分散液，按1∶2、1∶3、1∶4、1∶5傳代比例傳代培養。72 h觀察，按1∶2比例傳代細胞生長過于緊密，死細胞較多；按1∶3、1∶4比例傳代的細胞長滿單層，形態良好；按1∶5傳代的細胞沒有長滿單層。72 h傳代后又繼續傳代，連續傳代4次，按1∶2比例得傳代細胞生長依然過于緊密，細胞層較厚，死細胞較多；按1∶5比例的傳代細胞仍未能長成符合要求的細胞單層；按1∶3、1∶4比例的傳代細胞均能達到所需厚度，而且生長形態良好。

（二）確定不同接毒量對病毒增殖的影響

在培養條件相同的情況下，以CPE達80%左右時收獲，測定原液病毒含量。試驗數據表明，1%、2%的接毒量制備的原液病毒含量最高，并且原液效價非常穩定，CPE達80%左右收獲時，培養時間也大致相同。

（三）培養液中不同血清含量的比較試驗

試驗數據表明，4種血清濃度均能很好的復制病毒，4種收獲原液病毒含量相差不多，考慮到疫苗成本和以及血清含量增加所帶來的安全性隱患等因素，所以在該疫苗生產時，選用了1 %血清濃度。

（四）培養液不同加入量的對比試驗

試驗數據表明，瓶裝量為1 000 ml和1 200 ml的原液病毒含量測定結果相近，但考慮到確保細胞生長和病毒增殖過程中有足夠的營養供應。在疫苗生產時，選用了1 200 ml瓶裝量。

（五）病毒液不同收獲時間的對比試驗

在培養過程中，隨時觀察CPE變化，分別于CPE達70%、80%、90%以上時，收獲病毒原液，測定TCID50，比較不同收毒時間對病毒原液毒價的影響。試驗數據表明，以CPE達80%左右時，原液的病毒含量最高，即該疫苗的收獲時間為接毒后56～58 h收毒為宜。

（六）不同保存溫度和時間對病毒原液病毒含量的影響

不同保存溫度和保存時間對病毒效價的影響非常明顯。試驗數據表明，4℃僅可以短期保存，不可用該溫度長期保存該病毒原液。-80℃保存毒價效果最好，但對于大批生產的原液儲存條件過于苛刻。-20℃保存毒價下降較為緩慢，可以作為長期儲存條件。考慮生產成本和生產連續性，多采取4℃短期保存，快速凍干的生產工藝。

三、結論

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(HuN4-F112株)在大批生產中，最適宜細胞傳代比例為1∶4；接毒量為培養液總量的1%；細胞培養血清濃度為1%；制苗用病毒繁殖收獲時間為細胞80%病變程度時，培養時間約為56～58 h收獲；采用收獲后快速凍干原則，特殊情況-20℃保存不得超過2個月。這樣即可保證半成品原液的效價，又可以降低生產成本，節約勞動力，能夠給藍耳病疫苗的生產帶來一定的工藝優化成效。