苗期不同抗性大豆熒光參數及葉綠素含量對大豆花葉病毒脅迫的響應

齊玉鑫， 王燕平， 宗春美， 孫曉環， 白艷鳳， 任海祥， 杜維廣， 侯國強， 徐德海，李 文，王曉梅，張 帥

(黑龍江省農業科學院牡丹江分院/國家大豆改良中心牡丹江試驗站，黑龍江牡丹江 157041)

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苗期不同抗性大豆熒光參數及葉綠素含量對大豆花葉病毒脅迫的響應

齊玉鑫， 王燕平*， 宗春美， 孫曉環， 白艷鳳， 任海祥， 杜維廣， 侯國強， 徐德海，李 文，王曉梅，張 帥

(黑龍江省農業科學院牡丹江分院/國家大豆改良中心牡丹江試驗站，黑龍江牡丹江 157041)

[目的]研究苗期不同抗性大豆熒光參數和葉綠素含量對大豆花葉病毒(SMV)脅迫的響應。[方法]以感SMV品種合豐25和抗SMV品系牡304為材料，以東北地區SMVⅠ號株系為毒源，測定接種SMV后苗期不同抗性大豆熒光參數及葉綠素含量的變化。[結果]與對照相比，SMV脅迫下，除Fo和qN升高外，其他熒光參數均有所降低，抗SMV品種(系)的變化幅度較小。隨著脅迫時間的推移，Fm、Fm’、ΦPSII和Fv/Fm逐漸降低，Fo和qN逐漸升高，qP先降低后升高，且抗SMV品系牡304和感SMV品種合豐25分別在6 d和12 d出現最低值。受SMV脅迫后，葉綠素a和葉綠素b含量的變化趨勢相同，抗病品種(系)葉綠素含量的上升幅度大于感病品種(系)，感病品種(系)葉綠素含量的降低率大于抗病品種(系)。[結論]苗期熒光參數以及葉綠素含量可作為鑒定大豆對SMV抗性的重要依據。

大豆；SMV脅迫；熒光動力學參數；葉綠素含量

大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus，SMV)病是影響世界大豆生產的主要病害之一，也是目前我國東北、黃淮海、長江流域和南方大豆產區最重要的大豆病害之一。大豆花葉病毒隸屬馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)Y病毒屬(Potyvirus)大豆花葉病毒種。SMV在大豆植株上表現的癥狀非常復雜,有多種類型，主要與大豆品種、毒株類型、環境條件有關，也受播期和傳播介體的影響。SMV侵染大豆后會導致大豆葉片中葉綠素含量和葉質下降，葉面積減小，影響光合面積和光合能力，植株矮小，生長量下降，單株莢數減少，降低種子百粒重、萌發率、蛋白質含量和含油量,并影響脂肪酸、蛋白質、微量元素及游離氨基酸組分等，最終嚴重影響大豆產量[1]。感染SMV后的大豆病株籽粒會出現褐斑，嚴重時病粒率達50%以上[2]，當與菜豆莢斑駁病毒(BPMV)復合侵染大豆時出現斑駁的種子比例高達96%[3]，嚴重影響籽粒的外觀品質和商品價值。SMV在大豆分枝期至開花期為發病高峰，鼓粒期葉部癥狀開始潛隱，因此前人研究發現感染SMV后大豆的生理指標變化多從始花期到鼓粒期。在發病初期，大豆植株并無明顯癥狀，對這一時期大豆在SMV脅迫下的生理指標變化鮮見報道。筆者研究了大豆真葉期接種SMV后15 d內葉綠素含量和熒光參數的變化規律，并比較了抗病品種和感病品種在此期間葉綠素含量及熒光參數的差異，旨在為揭示SMV脅迫對不同抗性大豆苗期光合作用的影響以及大豆對SMV的抗性生理機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 選用黑龍江省農業科學院牡丹江分院選育的大豆新品系“牡304”作為抗病材料，該品種以黑農48為母本、以合豐47為父本通過有性雜交獲得，2011—2012年的病毒病抗病性鑒定中均表現為抗病；以合豐25為感病材料。供試毒源采用東北地區SMV 1號株系，由黑龍江省農業科學院大豆研究所提供。

1.2 試驗設計 試驗設置4個處理：Ⅰ為接種SMV的合豐25，Ⅱ為未接種SMV的合豐25，Ⅲ為接種SMV的牡304，Ⅳ為未接種SMV的牡304，3次重復。將供試大豆幼苗栽于營養缽中，接種病毒時期為大豆對生真葉期，接種病毒方法采用人工汁液摩擦法。幼苗接種后在智能溫室中培養，設定溫度25 ℃，光照18 h；20 ℃，黑暗6 h；從接種第3天開始，每隔6 d對葉綠素含量進行測定，每隔3 d對第1片復葉進行葉綠素熒光參數的測定。

1.3 測定指標與方法 使用調制式熒光儀mini-PAM(由德國WALZ公司生產)測定熒光動力學參數。葉片經暗適應20 min后,首先用弱測定光測定初始熒光Fo,隨后給1個強閃光測定最大熒光Fm。然后，在智能溫室恒定光源照射下適應20 min,當熒光基本穩定時測定熒光產量Ft,此后加1次強閃測量光適應的樣品的最大熒光產量Fm’。

按照下式計算光系統Ⅱ(PSⅡ)最大光化學量子產量：

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm

(1)

按照以下公式計算PSⅡ實際光化學量子產量:

ΦPSⅡ=(Fm’-Ft)/Fm’

(2)

按照以下公式計算光化學猝滅系數:

qP=(Fm’-Ft)/(Fm’-Fo)

(3)

按照以下公式計算非光化學猝滅系數:

qN=(Fm-Fm’)/(Fm-Fo)

(4)

葉綠素含量的測定采用牛俊義等[4]的乙醇丙酮混合法。

2 結果與分析

2.1 SMV脅迫對大豆苗期熒光參數的影響Fo是在暗適應狀態下當PSⅡ 的所有反應中心處于完全開放狀態(qP=1)并且所有的非光化學過程處于最小時(qN=0)的熒光產量，其大小與葉綠素濃度有關。陳建明等[5]研究表明Fo的增加可能是植物葉PSⅡ反應中心出現可逆的失活或出現不易逆轉的破壞,也可能是植物葉片類囊體膜受到損傷,而且Fo增加量越多,類囊體膜的受損程度就越嚴重。從表1可以看出，處理 Ⅱ與處理ⅣFo無顯著差異，都呈現出逐漸減小的趨勢；處理 ⅠFo從第9天開始與其他處理存在顯著差異，且逐漸增加；處理 Ⅲ 的Fo變化不大，且與處理Ⅱ、Ⅳ無顯著差異。通過對處理Ⅰ與Ⅲ的對比可知，在SMV脅迫下抗病植株Fo增加的幅度要遠遠小于感病植株，這說明抗病植株受SMV脅迫時PSⅡ 反應中心受到的影響更小。

Fm是在暗適應狀態下當PSⅡ的所有反應中心處于完全關閉狀態(qP=0)并且所有的非光化學過程處于最小(qN=0)時的熒光產量，Fm大小與QA的氧化還原狀態有關；Fm’是在光適應狀態下當PSⅡ的所有反應中心處于關閉態(qP=0)并且所有的非光化學過程處于最優態時(qN>0)的熒光產量，二者都可以反映出PSⅡ的電子傳遞情況。由表1可知，各處理Fm在6 d前無明顯差異，9 d后處理 Ⅰ與其他處理開始出現顯著差異，處理 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的Fm無明顯變化，處理ⅠFm逐漸下降。處理Ⅰ的Fm’從第3天開始與其他處理存在顯著差異，處理 Ⅲ從第12天開始與處理 Ⅰ、Ⅱ存在顯著差異，處理 Ⅱ、Ⅳ的Fm’無顯著變化，處理 Ⅰ、Ⅲ的Fm’均表現出下降趨勢，其中處理Ⅰ下降幅度較大。SMV脅迫下抗病植株和感病植株的PSⅡ反應中心電子傳遞都受到影響，抗病植株受到的影響小于感病植株。

Ft呈現出不規律變化，但第3天與第15天處理 Ⅰ 的Ft明顯降低，而其他3個處理沒有明顯變化。

表1 SMV脅迫對大豆苗期Fo、Fm、Fm’和Ft的影響

注：相同時間不同處理同一指標標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercases and capital letters of the same indicators in different treatments at the same time stand for significant difference(P<0.05).

2.2 SMV脅迫下ΦPSⅡ、Fv/Fm、qP與qN的變化ΦPSⅡ表示實際光化學量子產量，可反映PSⅡ反應中心部分關閉情況下實際光能捕獲的效率。從圖1可以看出，處理 Ⅰ 與處理Ⅲ的ΦPSⅡ顯著低于健康植株，處理 Ⅰ 與處理 Ⅲ 的ΦPSⅡ均呈下降趨勢，說明在SMV脅迫下抗病植株與感病植株捕獲光能的能力都受到了影響。研究表明，受SMV侵染的大豆葉片葉綠素含量下降，這可能是受SMV脅迫時大豆植株捕獲光能能力下降的主要因素。

葉綠素熒光參數Fv/Fm表示最大光化學量子產量，可反映PSⅡ反應中心內部光能的轉換效率。非脅迫條件下，該參數的變化極小,不受物種和生長條件的影響；脅迫條件下，Fv/Fm明顯下降。該研究結果表明，SMV對大豆葉片Fv/Fm有顯著影響，SMV脅迫下的大豆植株Fv/Fm比未受脅迫的大豆植株低，處理Ⅰ大豆植株的Fv/Fm呈顯著下降趨勢，且其下降幅度很大，而處理 Ⅲ 大豆植株的Fv/Fm基本保持穩定(圖1)。這說明抗病品種SMV脅迫后，抗病植株PSⅡ 反應中心仍然能夠保持較高的活性。

圖1 SMV脅迫下Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP和qN的變化Fig.1 Changes of Fv/Fm,ΦPSⅡ, qP and qN under SMV stress

光化學淬滅系數反映PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的份額,若要維持高的光化學淬滅就要使PSⅡ反應中心處于開放狀態,因此光化學淬滅系數在一定程度上反映PSⅡ反應中心的開放程度。光化學淬滅系數反映PSⅡ原初電子受體QA的還原狀態,它由QA重新氧化形成[6]。光化學淬滅系數qP愈大，PSⅡ的電子傳遞活性愈大[7]。處理 Ⅰ、Ⅲ的qP均呈現先下降后上升趨勢，處理Ⅲ的qP最低值出現在第6天，處理 Ⅰ 的qP最低值出現在第12天(圖1)。這表明大豆葉片在SMV脅迫下受到破壞的PSⅡ電子傳遞是可以逐漸修復的，抗病植株自我修復的能力要優于感病植株。

qN反映PSⅡ線色素吸收的不能用于光合電子傳遞而以熱形式耗散掉的光能部分，它是一種自我保護機制，對光合機構起到一定的保護作用，qN的升高說明PSⅡ正受到破壞。未受SMV脅迫處理 Ⅱ、Ⅳ的qN變化不大，處理Ⅰ的qN出現較明顯上升，處理ⅢqN上升幅度小于處理Ⅰ(圖1)。這表明隨著SMV脅迫時間的增加，PSⅡ天線色素吸收的光能用于光合作用所占的份額在逐漸減少，抗病植株的減小幅度小于感病植株。

2.3 SMV脅迫對大豆苗期葉綠素含量的影響 葉綠素a是光合反應中心復合體的主要組成成分，其中處于特殊狀態的反應中心葉綠素a分子是執行能量轉化的光合色素，而葉綠素a 是捕光色素蛋白復合體的重要組成部分，其主要作用是捕獲和傳遞光能，它們在活體中大概都是與蛋白質結合在一起，存在于類囊體膜上[8]。由表2可知，4個處理的葉綠素a含量均隨著脅迫時間的推移而增加，相同品種(系)受脅迫的處理葉綠素a含量的增加速度要低于未受脅迫的處理；同一品種同一時間不同處理葉綠素a含量差異不大，只有合豐25在15 d受脅迫的處理 Ⅰ 與未受脅迫的處理 Ⅱ 存在顯著差異；合豐25葉綠素a含量的降低率隨著脅迫時間的推移而增加，牡304的葉綠素a含量則呈現出先下降后上升的趨勢，其降低率都在15 d出現明顯上升，合豐25葉綠素a含量的上升幅度大于牡304。

由表2可知，葉綠素b含量的變化規律與葉綠素a基本相同。3 d和9 d相同品種的2個處理葉綠素含量并沒有明顯的變化，15 d相同品種的2個處理葉綠素含量的降低率都明顯升高，合豐25在15 d受脅迫的處理 Ⅰ 與未受脅迫的處理 Ⅱ 葉綠素b含量存在顯著差異。

表2 SMV脅迫對大豆苗期葉綠素含量的影響

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercases in the same column stand for significant difference(P<0.05).

3 討論

陳兵等[9]研究表明，棉花在黃萎病脅迫下，隨著病害嚴重度的增加，棉葉葉綠素 a、葉綠素 b、葉綠素 a+b、葉片含水率，病葉葉綠素熒光參數可變熒光、最大熒光、光系統 Ⅱ 最大光化學效率、光系統 Ⅱ 的潛在活性、最大熒光與最小熒光比、光系統 Ⅱ 的量子產額均減小，而初始熒光增加。柯玉琴等[10]研究表明青枯病侵染的煙草葉片Fv、Fv/Fm、Fv/Fo受到抑制,感病品種抑制程度大于抗病品種。鄭國華[11]研究表明感染炭疽病的枇杷葉片Fv、Fv/Fm、Fv/Fo及量子產量受到抑制。楊峰等[12]研究表明受根腐病脅迫后，大豆植株樣本葉片熒光參數Fv/Fm、NPQ、ΦPSⅡ均極低于正常植株。穆西玉等[13]研究表明玉米感大斑病后各品種葉片葉綠素含量顯著降低，葉綠素含量從高到低依次為感病品種、中抗品種、抗病品種,這與該研究結果相一致。馬鈴薯Y病毒(PVY)侵染后不同發育期馬鈴薯葉片的光合參數表明，侵染初期病株的凈光合速率(Pn)、Fv/Fm、電子傳遞速率(ETR) 與健康植株基本相同，隨著發育進程的推進，病株的Pn和ETR下降速度顯著大于健康株,而Fv/Fm則變化不大[14]。這與該試驗結果不同，這可能是因為不同種植物對不同病原菌的抗性差異所造成的。

病害脅迫會造成葉綠體結構的破壞和葉綠素含量的變化，從而影響植物的光合作用。電鏡掃描接種SMV Nl株系21 d的細胞超微結構發現，細胞形狀異常,少數細胞有質壁分離現象發生，細胞核中核仁融解，葉綠體腫脹變形,淀粉粒減少，葉綠體上嗜鋨顆粒增加， 顏色加重，邊緣清晰，基粒和基質片層斷裂細胞壁附近的線粒體數目增多[15]。Balachandran等[16]研究表明植物感染病毒后除表現為葉綠體遭到破壞、葉綠素含量下降外，一些病程相關蛋白酶的活性得以提高，使正常生長發育受到抑制。植物感染煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)等病毒后，葉綠體內發生病毒積累，放氧復合體(OCE)中的多肽成分發生變化，光系統 Ⅱ(PSⅡ)電子傳遞顯著降低，同時，病毒外殼蛋白CP積累于葉綠體內光化學反應中心之間，誘導產生光抑制，從而降低植物的光合作用[17]。這些都是病毒侵染植物體后導致其光合生理指標受到影響的因素。

除病害外，生理脅迫[18]和環境污染[19]等也會對植物光合生理產生影響。為避免植株長勢不同、其他病害和生理脅迫對研究成果造成影響，試驗選用的植株長勢一致，培養大豆幼苗所用的土壤高溫滅菌，營養缽全部經過紫外線照射消毒，避免出現復合侵染，試驗過程中每次用注射器向營養缽中加入等量的蒸餾水，避免出現因水分引起的生理脅迫。

葉綠素熒光動力學方法因其快速、靈敏、無損傷等優點，目前已被廣泛用于研究和探測各種逆境對植物光合生理的影響。該研究結果表明，不同抗性的大豆幼苗受SMV脅迫后抗病和感病品種(系)的PSⅡ系統捕捉光能的能力、反應中心活性和電子傳遞都受到影響，Fv/Fm、ΦPSII、qP、qN有顯著差異，抗病品種(系)受到的影響較小，綜合分析苗期熒光參數以及葉綠素含量可作為鑒定大豆對SMV抗性的重要依據之一。

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Effect of SMV Stress on Chlorophyll Fluorescence Parameters and Chlorophyll Content of Soybean with Different Resistant Levels at Seedling Stage

QI Yu-xin,WANG Yan-ping*,ZONG Chun-mei et al

(Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences/Mudanjiang Experiment Station of National Soybean Improvement Center,Mudanjiang,Heilongjiang 157041)

[Objective]The aim was to study effect of SMV stress on chlorophyll fluorescence parameters and chlorophyll content of soybean with different resistant levels at seedling stage.[Method] Hefeng25 and Mu304 were used as experiment materials,and virus source was SMVⅠ,effect of SMV stress on chlorophyll fluorescence parameters and chlorophyll content of soybean with different resistant levels at seedling stage was studied.[Result] The result showed that compared with control,under SMV stress,fluorescence parameters declined exceptFoandqNincreasing,and change range of SMV-resistant variety(line) was smaller.Fm,Fm’,ΦPSIIandFv/Fmdeclined,FoandqNincreased andqPfirstly decreased and then increased with the day passing,the minimumqPvalue of Mu304 and Hefeng 25 respectively happened in sixth and twelfth day.Changes of chlorophyll a and b were same under SMV stress,change range of chlorophyll content resistant variety(line)>susceptible variety(line),reduction rate of chlorophyll content resistant variety(line)>susceptible variety(line).[Conclusion] Chlorophyll fluorescence parameters and chlorophyll content at seedling stage can be used as important basis for identifying SMV resistance of soybean.

Soybean; SMV stress; Chlorophyll fluorescence parameters; Chlorophyll content

國家自然科學基金面上項目(31371651)；中國科學院大豆分子設計育種重點實驗室開放課題(SMDB-02)。

齊玉鑫(1983- )，男，河北滄縣人，助理研究員，碩士，從事大豆抗病育種研究。*通訊作者，副研究員，博士，從事大豆抗逆育種研究。

2016-08-03

S 565.1

A

0517-6611(2016)28-0007-04