產淀粉酶菌種的分離純化及培養條件研究

紀韋韋，張小華，高 靜

(江蘇農林職業技術學院，江蘇句容 212400)

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產淀粉酶菌種的分離純化及培養條件研究

紀韋韋，張小華，高 靜

(江蘇農林職業技術學院，江蘇句容 212400)

[目的]探究產淀粉酶菌種的分離純化及培養條件。[方法]從土壤中分離到1株產淀粉酶能力較強的細菌A并分離純化培養。[結果]細菌A在以淀粉為碳源的培養基上產淀粉酶能力最強，水解圈平均直徑/菌種平均直徑(R2/R1)為2.69；在以硝酸鈉為氮源的培養基上產淀粉酶能力最強，R2/R1為2.69；pH在7.5時產淀粉酶能力最強，R2/R1為2.95。[結論]以淀粉為碳源、以硝酸鈉為氮源、pH在7.5的培養基有利于細菌A產淀粉酶能力的提高。

淀粉酶；培養基；培養條件

最初，淀粉酶(amylase)一詞用來指可以水解直鏈淀粉、支鏈淀粉、肝糖及其降解產品中α-1，4-糖苷鍵的酶，它們水解相鄰葡萄糖單體之間的鍵，產生葡萄糖[1]。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉 、糖元等α-1，4-葡聚糖，水解α-1，4-糖苷鍵的酶[1]。

淀粉酶是淀粉降解酶，廣泛存在于微生物、植物和動物體中，是人們經常研究的一種酶。從紡織工業到廢水處理，淀粉酶都有著不同規模應用，尤其是堿性淀粉酶在各種洗滌劑產品中有廣泛應用。在某種程度上，淀粉酶也被用作消化助劑，補充面粉的糖化活性，改善一些動物飼料的可消化性[2-3]。由于淀粉酶應用廣泛，大部分由微生物產生，筆者擬通過淀粉水解來分離篩選可產淀粉酶的菌體，并對其進行研究，為今后的淀粉酶提取奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基。含淀粉的細菌培養基：氯化鈉 0.5 g，硝酸銨 1.0 g，硫酸銨0.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，七水合硫酸鎂0.2 g，淀粉 1.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH自然，瓊脂18.0 g[4-5]。

察氏培養基：淀粉 30.0 g，硝酸鈉 2.0 g，磷酸氫二鉀 1.0 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀 0.5 g，七水合硫酸亞鐵0.1 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2，瓊脂20.0 g[6]。

1.1.2 儀器。玻璃棒，250 mL大燒杯，50 mL小燒杯稱量紙，天平，100 mL量筒，搪瓷缸，微波爐，pH試紙，150 mL三角瓶，培養皿，移液槍，20、100 μL槍頭，1 mL無菌注射器，過濾器，吸管，報紙，包扎繩，YXQ-LS-50 立式壓力蒸氣滅菌器(上海博田實業有限公司醫療設備廠)，超凈工作臺 SW-CJ-2FD(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)，SPX-250B-Z型 生化培養箱(上海博田實業有限公司醫療設備廠)，LRH-250 生化培養箱(上海其欣科學儀器有限公司)，高低溫搖床培養箱 (上海精宏實驗設備有限公司)。

1.1.3 樣品。土壤(用直徑為3.5 cm 的土鉆采集5 鉆0 ～ 20 cm 深度土壤，混合為1個土樣，過2 mm篩后放在4 ℃冰箱保存)，發霉的馬鈴薯。

1.2 方法

1.2.1 淀粉酶產生菌的分離。稱取1.0 g土壤，加99 mL水攪拌均勻，靜置5 min，取上清液0.5 mL加入到裝有4.5 mL無菌水的試管中稀釋并混勻，重復稀釋1、2、3次，分別制得1∶104、1∶105、1∶106提取液[6-7]。

取上述提取液各0.2 mL加入到含淀粉的細菌培養基和察氏培養基中，涂布，37 ℃培養3 d；同時，將馬鈴薯上的霉菌接種到含淀粉的細菌培養基和察氏培養基中，28 ℃培養3 d；將培養好的平皿放入4 ℃冰箱中冷藏24 h，觀察水解圈的大小[8-10]。

1.2.2 淀粉酶產生菌的純化。觀察冷藏過的平皿上是否產生透明水解圈，將具有明顯水解圈的細菌在察氏培養基中劃線分離，37 ℃培養3 d；重復上述操作，直至產生單菌落。

1.2.3 不同培養條件產淀粉酶能力的研究。吸取3 mL 0.9%的無菌生理鹽水，將其轉移到已純化好的細菌A平皿中，制成菌懸液[10]。

1.2.3.1 不同碳源的影響。在察氏培養基中加入相同碳濃度的不同碳源(葡萄糖、蔗糖和淀粉)，用移液槍移取100 μL上述菌懸液，將其轉移到裝有50 mL不同碳源的液體察氏培養基的150 mL三角瓶中，在設定28 ℃、80 r/min搖床培養。培養3 d后取樣，用細菌過濾器過濾培養液，再用移液槍移取20 μL無菌濾液，將其放在察氏培養基上，培養條件同1.2.1。

1.2.3.2 不同氮源的影響。在察氏培養基中加入相同氮濃度的不同氮源(硫酸銨、硝酸鈉)，用移液槍移取100 μL上述菌懸液，將其轉移到裝有50 mL不同氮源的液體察氏培養基的150 mL三角瓶中，在設定28 ℃、80 r/min搖床培養。培養3 d后取樣，用細菌過濾器過濾培養液，再用移液槍移取20 μL無菌濾液，將其放在察氏培養基上，培養條件同“1.2.1”。

1.2.3.3 不同pH的影響。將察氏培養基pH調為6.4、7.0、7.5，用移液槍移取100 μL上述菌懸液，將其轉移到裝有50 mL不同pH的液體察氏培養基的150 mL三角瓶中，在設定28 ℃、80 r/min搖床培養。培養3 d后取樣，用細菌過濾器過濾培養液，然后用移液槍移取20 μL無菌濾液，將其放在察氏培養基上，培養條件同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 淀粉酶產生菌的分離 在細菌培養基上，無論是土壤或者發霉馬鈴薯中生長的菌體均沒有水解圈產生。而在察氏培養基上則出現了大小不一、清晰可見的水解圈。對圖1中產淀粉酶的細菌菌落進行觀察發現，產淀粉酶細菌A菌落為黃色，質地較硬，無黏稠感；產淀粉酶細菌B菌落為深黃色，質地偏軟，有黏稠感。

2.2 淀粉酶產生菌的純化 純化后的細菌A產生明顯的水解圈，如圖2所示。

經過菌種的3次純化，從表1可以看出，第1、2、3次純化后的R2/R1分別為1.75、1.95、4.40，表明菌種越純，產生的淀粉酶越多，水解圈越大，酶活性越大。

注：a.第1次純化； b.第2次純化；c.第3次純化。 Note：a.The first purification；b.The second purification；c.The third purification.圖2 純化后的細菌AFig.2 Purified bacterium A

純化次數Purification菌種直徑Diameterofthestrain∥cm菌種平均直徑(R1)Averagediameterofthestrain∥cm水解圈直徑Diameterofahydrolyzationcircle∥cm水解圈平均直徑(R2)Averagediameterofhydrolyzationcircles∥cmR2/R1第1次Thefirsttime0．400．401．000．701．750．500．700．400．600．300．50第2次Thesecondtime1．101．052．002．051．951．002．10第3次Thethirdtime0．400．451．801．984．400．502．100．502．100．401．90

2.3 不同培養條件對產淀粉酶能力的影響

2.3.1 不同碳源的影響。不同碳源的培養效果見圖3。從表2可知，經過不同碳源的培養，以葡萄糖、蔗糖和淀粉為碳源的培養基R2/R1分別為0、2.42和2.69，表明細菌A不能在以葡萄糖為碳源的培養基上生長，能在以蔗糖為碳源的培養基上生長，但效果沒有以淀粉為碳源的培養基上更明顯。

注：a.以蔗糖為碳源，b.以葡萄糖為碳源，c.以淀粉為碳源。 Note：a.Sucrose；b.Glucose；c.Starch.圖3 不同碳源的培養效果Fig.3 Effects of various carbon sources on the ability to produce amylase

碳源Carbonsource菌種直徑Diameterofthestrain∥cm菌種平均直徑(R1)Averagediameterofthestrain∥cm水解圈直徑Diameterofahydrolyzationcircle∥cm水解圈平均直徑(R2)Averagediameterofhydrolyzationcircles∥cmR2/R1葡萄糖Glucose0．500．50000葡萄糖Glucose0．500葡萄糖Glucose0．500葡萄糖Glucose0．500蔗糖Sucrose1．001．122．202．722．42蔗糖Sucrose1．503．20蔗糖Sucrose1．002．80蔗糖Sucrose1．002．70淀粉Starch1．001．053．002．822．69淀粉Starch1．102．80淀粉Starch1．102．80淀粉Starch1．002．70

2.3.2 不同氮源的影響。不同氮源的培養效果見圖4。從表3可知，經過不同氮源的培養，以硫酸銨、硝酸鈉為氮源的培養基R2/R1分別為2.54、2.69，表明細菌A能在以硫酸銨為氮源的培養基上生長并能產生水解圈，以硝酸鈉為氮源的培養基產生的水解圈更大更明顯。

注：a.以硫酸銨為氮源，b.以硝酸鈉為氮源。 Note：a.Ammonium sulfate；b.Sodium nitrate.圖4 不同氮源的培養效果Fig.4 Effects of various nitrogen sources on the ability to produce amylase

2.3.3 不同pH的影響。不同pH的培養效果見圖5。從表4可知，經過不同pH的培養，pH為6.4、7.0和7.5的培養基R2/R1分別為1.82、2.69和2.95，由此可知細菌A在pH為7.0、7.5的環境下R2/R1偏大，說明細菌A在中性或偏堿性的環境中生長旺盛。

表3 不同氮源條件下產酶效果

注：a.pH為6.4 ，b.pH為7.0，c.pH為7.5。 Note：a.pH.6.4 ，b.pH.7.0，c.pH.7.5。圖5 不同pH的培養效果Fig.5 Influences of different pH values on the ability to produce amylase

pH菌種直徑Diameterofthestrain∥cm菌種平均直徑(R1)Averagediameterofthestrain∥cm水解圈直徑Diameterofahydrolyzationcircle∥cm水解圈平均直徑(R2)Averagediameterofhydrolyzationcircles∥cmR2/R16．41．101．222．102．221．826．41．002．006．41．402．306．41．402．507．01．001．053．002．822．697．01．102．807．01．102．807．01．002．707．51．001．053．003．102．957．50．903．207．51．102．907．51．203．30

3 結論與討論

(1)產淀粉酶細菌A在以葡萄糖為碳源的培養基上不能生長，在以蔗糖和淀粉為碳源的培養基上R2/R1分別為2.42和2.69，由此可知細菌A在以淀粉為碳源的培養基上產生的水解圈最大，說明細菌A在淀粉培養基上生長最好。

(2)細菌A在以硫酸銨、硝酸鈉為氮源的培養基上R2/R1分別為2.54、2.69，說明細菌A在這2種氮源上都能生長，以硝酸鈉為氮源的培養基更適合細菌A的生長。

(3)細菌A在pH為6.4、7.0和7.5的培養基上R2/R1分別為1.82、2.69和2.95，說明pH在6.4～7.5，隨著pH的增大，R2/R1不斷增大，細菌A的活性也越來越大。

綜上所述，細菌A在以淀粉為碳源、硝酸鈉為氮源、pH在7.5時R2/R1偏大，在此培養基上細菌A的生長旺盛。

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Study on Separation, Purification and Culture Conditions of an Amylase Producing Strain

JI Wei-wei, ZHANG Xiao-hua, GAO Jing

(Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry, Jurong, Jiangsu 212400)

[Objective] To explore the separation, purification and culture conditions of an amylase producing strain. [Method] Bacterium A, which had a strong ability to produce amylase, was isolated from the soil and then purified and cultured. [Result] Bacterium A had the strongest ability to produce amylase in the medium using starch as the carbon source, and the ratio of the average diameter of hydrolyzation circlesR2to the average diameter of the strainR1(calledR2/R1for short) was 2.69; when being cultured in the medium using sodium nitrate as the nitrogen source, bacterium A had the strongest ability to produce amylase, andR2/R1was 2.69; as the pH of the medium was 7.5, the ability to produce amylase was the strongest, andR2/R1was 2.95. [Conclusion] Bacterium A should be cultured in the medium where starch and sodium nitrate are as the carbon source and the nitrogen source and pH is 7.5 to improve the ability to produce amylase.

Amylase; Medium; Culture conditions

紀韋韋(1981- )，男，江蘇句容人，講師，從事食品加工與質量控制研究。

2016-07-22

Q 556+.2

A

0517-6611(2016)28-0003-04