改進HPLC法測定吲哚美辛腸溶片中的有關物質

李　超（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶　401121）

改進HPLC法測定吲哚美辛腸溶片中的有關物質

李超＊（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶401121）

目的：改進高效液相色譜法測定吲哚美辛腸溶片中2-甲基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸（以下簡稱雜質Ⅰ）和4-氯苯甲酸（以下簡稱雜質Ⅱ）的含量。方法：色譜柱為Phenomenex Phenyl-Hexyl，流動相為10 g/L醋酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為40℃，進樣量為20 μl。結果：雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的檢測質量濃度線性范圍分別為0.262 2～5.243 0、0.252 5～5.050 0 μg/ml（r均為0.999 8）；定量限分別為1.12、0.48 ng，檢測限分別為0.340、0.146 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2%；雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的加樣回收率分別為99.71%～100.52%（RSD=0.28%，n=9）、100.84%～102.14%（RSD= 0.47%，n=9）。結論：該方法準確、快速，可用于吲哚美辛腸溶片中雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的含量測定。

高效液相色譜法；吲哚美辛腸溶片；2-甲基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸；4-氯苯甲酸

吲哚美辛為吲哚乙酸類非甾體消炎藥［1］，臨床上主要用于抗炎、抗風濕及解熱鎮痛等［2］。其作用機制為通過抑制環氧化酶，從而減少前列腺素的合成，制止炎癥組織痛覺神經沖動的形成，抑制炎性反應［3］，也可用于癌癥發熱并有一定的抗腫瘤作用，可抑制結腸腫瘤細胞增殖并誘導凋亡［4-7］。但該藥不良反應較多，主要為胃腸道反應，也有哮喘［8-11］、致粒細胞缺乏［12］等不良反應的報道。2-甲基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-乙酸（以下簡稱雜質Ⅰ）和4-氯苯甲酸（以下簡稱雜質Ⅱ）為吲哚美辛的工藝雜質，不可避免，而且是引起不良反應的主要因素。2010年版《中國藥典》（二部）［13］和2015年版《中國藥典》（二部）［14］收載了吲哚美辛腸溶片，均采用高效液相色譜法（HPLC）測定有關物質的含量，且兩版藥典中對吲哚美辛腸溶片有關物質的測定方法一致，無修訂，但該方法不能有效檢出吲哚美辛腸溶片的雜質Ⅰ和雜質Ⅱ。為更好地控制該藥的質量，筆者參考2015年版《英國藥典》中吲哚美辛有關物質的測定方法［15］，對2015年版《中國藥典》（二部）中吲哚美辛腸溶片有關物質測定方法進行了改進。

1　材料

1.1儀器

e2695型HPLC儀，包括2489型紫外檢測器（美國Waters公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）；XP205型萬分之一電子天平（瑞士萬通有限公司）。

1.2藥品與試劑

吲哚美辛腸溶片（A廠，批號：140502、131201、150201，規格：25 mg/片；B廠，批號：150401、150101、150601，規格：25 mg/片；C廠，批號：1407006、1402002、1502002，規格：25 mg/片；D廠，批號：141002、140701、141102、150601，規格：25 mg/片；E廠，批號：140804、150501、140502、141105，規格：25 mg/片；F廠，批號：A141002、A130703、A150103，規格：25 mg/片；G廠，批號：17140202、130801、1715003，規格：25 mg/片；H廠，批號：20150102，規格：25 mg/片；I廠，批號：140201，規格：25 mg/片；J廠，批號：815001、824001、774001，規格：25 mg/片）；雜質Ⅰ對照品（西亞試劑有限責任公司，批號：B55980，純度：98%）；雜質Ⅱ對照品（天津市光復精細化工研究所，批號：20150417，純度：100%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Phenomenex Phenyl-Hexyl（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相：10 g/L醋酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；柱溫：40℃；進樣量：20 μl。

2.2溶液的配制

2.2.1混合對照品溶液精密稱取雜質Ⅰ對照品和雜質Ⅱ對照品各約12.5 mg，精密稱定，置于同一10 ml量瓶中，加50%乙腈溶解并稀釋制成每1 ml含雜質Ⅰ和雜質Ⅱ各5 μg的混合對照品溶液。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient edution program

2.2.2供試品溶液取樣品細粉適量（約相當于吲哚美辛50 mg），精密稱定，置于50 ml量瓶中，加50%乙腈適量，超聲處理10 min，使其溶解，放冷，加50%乙腈定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液取50%乙腈溶液作為陰性對照溶液。

2.3系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞2；理論板數以吲哚美辛峰計為50 000。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖A.供試品；B.混合對照品；C.陰性對照；1.雜質Ⅰ；2.雜質Ⅱ；3.吲哚美辛Fig 1　HPLC chromatogramsA.test sample；B.mixed reference substance；C.negative control；1.impurityⅠ；2.impurityⅡ；3.indometacin

2.4破壞性試驗

（1）光破壞：精密稱取樣品細粉適量，分別置于1 500 lx燈下照射24 h，再按“2.2.2”項下方法制備光破壞試驗溶液。（2）熱破壞：精密稱取樣品細粉適量，置于120℃烘箱中烘烤24 h，取出后冷卻至室溫，再取上述烘烤后的細粉適量，按“2.2.2”項下方法制備熱破壞試驗溶液。（3）酸破壞：精密稱取樣品細粉適量，加2 mol/L鹽酸溶液5 ml，于室溫下放置80 min，再加2 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至中性，再按“2.2.2”項下方法制備酸破壞試驗溶液。（4）堿破壞：精密稱取樣品細粉適量，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，于室溫下放置8 min，加0.1 mol/L鹽酸溶液調節pH至中性，再按“2.2.2”項下方法制備堿破壞試驗溶液。（5）氧化破壞：精密稱取樣品細粉適量，加30%過氧化氫溶液10 ml，搖勻，于室溫下放置2 h，再按“2.2.2”項下方法制備氧化破壞試驗溶液。分別取上述破壞試驗溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，樣品在酸堿條件下不穩定，能夠降解出雜質Ⅰ和雜質Ⅱ；在光破壞、熱破壞和氧化破壞條件下比較穩定，不易被破壞。

圖2　破壞性試驗高效液相色譜圖A.酸破壞；B.堿破壞；C.氧化破壞；D.光破壞；E熱破壞；1.雜質Ⅰ；2.雜質Ⅱ；3.吲哚美辛Fig 2　HPLC chromatograms of destructive testA.sample destroyed by acid；B.sample destroyed by alkali；C.sample destroyed by oxidation；D.sample destroyed by light；E.sample destroyed by heating；1.impurityⅠ；2.impurityⅡ；3.indometacin

2.5線性關系考察

取雜質Ⅰ對照品和雜質Ⅱ對照品各約25 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加50%乙腈溶解并定容，搖勻，作為單一對照品貯備液。分別取上述單一對照品貯備液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得雜質Ⅰ的回歸方程為y=17 756x－983.32（r=0.999 8）、雜質Ⅱ的回歸方程為y=42 670x－1 637（r=0.999 8）。結果表明，雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的檢測質量濃度線性范圍為0.262 2～5.243 0、0.252 5～5.050 0 μg/ml。

2.6定量限與檢出限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限分別為1.12、0.48 ng；當信噪比為3∶1時，得檢測限分別為0.340、0.146 ng。

2.7精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，雜質Ⅰ和雜質Ⅱ峰面積的RSD分別為0.22%、0.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8穩定性試驗

精密量取“2.2.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，雜質Ⅰ和雜質Ⅱ峰面積的RSD分別為0.67%、0.70%（n=5），表明供試品溶液在室溫下8 h內穩定性良好。

2.9重復性試驗

取同一批樣品（批號：1715003）適量，除去包衣后研細，稱取約2片細粉（約相當于吲哚美辛50 mg），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，雜質Ⅰ和雜質Ⅱ峰面積的RSD分別為0.81%、0.75%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.10加樣回收率試驗

取樣品（批號：1715003）適量，除去包衣后研細，取約2片細粉（約相當于吲哚美辛50 mg），精密稱定，分別置于50 ml量瓶中，分別加入“2.2.1”項下混合對照品溶液1.0、2.0、3.0 ml，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得系列溶液。取上述系列溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果詳見表2。

表2　加樣回收率試驗結果（n=9）Tab 2　Results of recovery tests（n=9）

2.11樣品含量測定

分別取28批樣品各適量，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的含量，結果詳見表3。

3　討論

3.1檢測波長的選擇

筆者曾考察了檢測波長（228、240和254 nm），發現在228 nm和240 nm波長處，系統基線不穩定，影響了雜質的檢測，而在254 nm波長處基線穩定且雜質檢測結果也較好。因此，本試驗最終選擇254 nm作為檢測波長。

3.2破壞性試驗條件的確定

在進行酸破壞試驗時，筆者曾用1、2、6 mol/L的鹽酸溶液進行酸破壞。結果顯示，1 mol/L的鹽酸溶液基本無法破壞出雜質，說明破壞條件不夠劇烈；6 mol/L的鹽酸溶液破壞出的雜質峰過大，以至于主峰吲哚美辛的峰面積過小（＜50%），說明條件過于劇烈。因此，最終采用2 mol/L的鹽酸溶液進行酸破壞試驗，主峰的峰面積適宜（占80%左右），說明該破壞試驗條件適用，且破壞出的雜質能被有效檢出。

在進行堿破壞試驗時，筆者曾用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液分別破壞2、8、15、30 min。結果顯示，15 min以上的破壞使得主峰吲哚美辛被破壞過多（＜50%），2 min的破壞時間過短，主峰吲哚美辛基本沒有被破壞。因此，最終確定8 min的破壞時間，破壞之后主峰的峰面積適宜（占80%左右），說明該破壞試驗條件適用，且破壞出的雜質能被有效檢出。

其他光、熱和氧化破壞條件均沒有破壞出雜質，說明本品對光、熱和氧化條件比較穩定。

表3　樣品含量測定結果（n=3，%）Tab 3　Results of related substances determination of samples（n=3，%）

綜上所述，本方法準確、快速，可用于吲哚美辛腸溶片雜質Ⅰ和雜質Ⅱ的含量測定。

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［15］ British Pharmacopoeia Commission office.British Pharmacopeia.：European Pharmacopoeia VolumeⅡ［S］.2015：1 204-1 206.

（編輯：劉柳）

Determination of Related Substance in Indometacin Enteric-coated Tablet by Improving HPLC

LI Chao（Chongqing Institute For Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

OBJECTIVE：To improve HPLC for the contents determination of 2-methyl-5-methoxy-indole-3-acetic acid（impurityⅠ）and 4-chlorobenzoic（impurityⅡ）in Indometacin enteric-coated tablet.METHODS：The column was Phenomenex Phenyl-Hexyl with mobile phase of 10 g/L acetic acid solution-acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 254 nm，column temperature was 40℃，injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 0.262 2-5.243 0 μg/ml for impurityⅠ（r=0.999 8）and 0.252 5-5.050 0 μg/ml for impurityⅡ（r=0.999 8）；the limits of quantitation were 1.12 ng and 0.48 ng，limits of detection were 0.340 ng and 0.146 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 99.71%-100.52%（RSD=0.28%，n=9）and 100.84%-102.14%（RSD=0.47%，n= 9）.CONCLUSIONS：The method is accurate and rapid，and can be used for the contents determination of impurityⅠand impurityⅡin Indometacin enteric-coated tablet.

HPLC；Indometacin enteric-coated tablet；2-methyl-5-methoxy-indole-3-acetic acid；4-chlorobenzoic

R927.2

A

1001-0408（2016）27-3861-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.39

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物分析。E-mail：179320851 @qq.com

（2016-01-21

2016-07-04）