HPLC法同時測定跌打丸中芍藥苷和丹皮酚的含量

竇紅允，黃東杰，王孟陽，張　潔，王曉琦，田永慶（滄州市食品藥品檢驗(yàn)所，河北滄州　061001）

HPLC法同時測定跌打丸中芍藥苷和丹皮酚的含量

竇紅允＊，黃東杰，王孟陽，張潔，王曉琦，田永慶（滄州市食品藥品檢驗(yàn)所，河北滄州061001）

目的：建立同時測定跌打丸中芍藥苷和丹皮酚含量的方法，為提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為ZORBAX C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脫），流速為0.8 ml/min，檢測波長為230 nm（芍藥苷）、274 nm（丹皮酚），柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：芍藥苷和丹皮酚的檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.514 8～1.544 5 μg（r=0.999 2）、0.643 2～1.960 4 μg（r=0.999 8）；定量限分別為0.135 6、0.126 4 μg、檢測限分別為0.067 8、0.063 2 μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率分別為95.78%～97.27%（RSD=0.62%，n=6）、97.38%～98.38%（RSD=0.42%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高，可用于同時測定跌打丸中芍藥苷和丹皮酚的含量。

跌打丸；芍藥苷；丹皮酚；含量測定；高效液相色譜法

跌打丸是2015年版《中國藥典》（一部）收載的常用復(fù)方中藥，由三七、赤芍、白芍、牡丹皮、血竭、骨碎補(bǔ)、乳香、沒藥、甘草等24味中藥材組成，具有活血散瘀、消腫止血之功效，可用于跌打損傷、筋斷骨折、淤血腫痛、閃腰岔氣等證［1］。赤芍和白芍基源相近，主成分相同，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，赤芍和白芍具有抗炎、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等作用［2］，是跌打丸中起活血散瘀、消腫止血的重要藥物。牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀的功能［1］，是跌打丸中的有效成分之一。赤芍和白芍其主要活性成分為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷等單萜類成分。牡丹皮主要含有丹皮酚等酚酸類成分和芍藥苷等糖苷類成分［3］。在2015年版《中國藥典》（一部）中只用血竭素高氯酸鹽定量，考慮到芍藥苷和丹皮酚是與跌打丸功效相關(guān)的重要活性成分，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)［4-7］，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定跌打丸中芍藥苷和丹皮酚的含量，為提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1　材料

1.1儀器

1260型HPLC儀，包括1260ALS自動進(jìn)樣器、1260VWD檢測器、hp-5工作站（美國Agilent公司）；XS105DU型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-300VED型雙頻數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300 W，頻率：45 kHz）。

1.2藥品與試劑

跌打丸（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號：14010074、13012817、13012033，規(guī)格：3 g/丸）；芍藥苷對照品（批號：110736-201337，純度：94.9%）、丹皮酚對照品（批號：110708-200506，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h以上使用）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：230 nm（芍藥苷）、274 nm（丹皮酚）；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　gradient elution program

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液精密稱取芍藥苷對照品0.010 85 g、丹皮酚對照品0.010 12 g，分別置于50 ml量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.217 0、0.202 4 mg/ml的單一對照品貯備液。分別精密量取上述芍藥苷對照品貯備液25 ml、丹皮酚對照品貯備液5 ml，置于同一100 ml量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液取樣品適量，剪碎，取約3.0 g，精密稱定，置于100 ml具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 ml，精密稱定，超聲處理40 min，放冷，精密稱定，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液按樣品的處方比例和制備工藝分別制備不含白芍、赤芍、牡丹皮的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)為5 000；保留時間為12 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.芍藥苷；2.丹皮酚Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference；B.test sample；C.negative control；1.paeoniflorin；2. paeonol

2.4線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0、10、15、20、25、30 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程為y=1.92x－52.25（r=0.999 2）、丹皮酚的回歸方程為y=6.48x－5.80（r=0.999 8）。結(jié)果表明，芍藥苷和丹皮酚的進(jìn)樣量線性范圍分別為0.514 8～1.544 5、0.643 2～1.960 4 μg。

2.5定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得芍藥苷和丹皮酚的定量限分別為0.135 6、0.126 4 μg；當(dāng)信噪比為3∶1時，得芍藥苷和丹皮酚的檢測限分別為0.067 8、0.063 2 μg。

2.6精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.36%和0.57%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為1.1%、1.2%（n=5），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：14010074）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.64%、0.83%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號：14010074）適量，共6份，每份約3.0 g，精密稱定，精密加入芍藥苷對照品3.34 mg、丹皮酚對照品5.82 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果詳見表2。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 2　Results of recovery tests（n=6）

2.10樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中芍藥苷和丹皮酚的含量，結(jié)果詳見表3。

表3　樣品含量測定結(jié)果（n=3，mg/g）Tab 3　Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3　討論

3.1提取溶劑的選擇

筆者通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)［3］，并根據(jù)待測成分的理化性質(zhì)，對提取溶劑進(jìn)行了考察和比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用50%乙醇提取時色譜峰雜質(zhì)較少，分離度更佳。因此，本試驗(yàn)選用50%乙醇為提取溶劑。

3.2流動相的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法測定中藥復(fù)方制劑中芍藥苷和丹皮酚的流動相系統(tǒng)有甲醇-1.5%冰乙酸［4］、甲醇-0.05%磷酸［5］、乙腈-0.1%磷酸［6-8］、乙腈-1%冰乙酸［9］、乙腈-水［10］、甲醇-水等，本試驗(yàn)比較了幾種流動相的檢測情況，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸為流動相時，樣品中芍藥苷和丹皮酚的色譜峰能達(dá)到基線分離，峰形良好，陰性對照無干擾；而采用其他流動相，樣品分離度均不夠理想。因此，本試驗(yàn)選用乙腈-0.1%磷酸為流動相。

綜上所述，本方法操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度高，可用于同時測定跌打丸中芍藥苷和丹皮酚的含量。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1 590、172.

［2］楊琪偉，楊莉，熊愛珍，等.赤芍和白芍抗炎作用的UPLC-MS代謝組學(xué)初步研究［J］.中國中藥雜志，2011，36（3）：694.

［3］孟慶煥，祖元剛，王化.牡丹種皮中芍藥苷和丹皮酚的優(yōu)化提取工藝［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（7）：68.

［4］趙佳麗，肖國棟，徐宏祥，等.HPLC法測定咽炎片中的黃芩苷、芍藥苷和丹皮酚［J］.華西藥學(xué)雜志，2014，29（4）：476.

［5］李向陽，屠萬倩.HPLC法測定六味地黃丸中丹皮酚、芍藥苷和烏蘇酸［J］.中成藥，2012，34（2）：277.

［6］毛曉敏，張曉波，陳小清，等.HPLC法測定十二烏雞白鳳丸中芍藥苷、阿魏酸和丹皮酚含量［J］.中成藥，2008，30（5）：678.

［7］馮發(fā)青，王恩源，伍慶，等.HPLC法同時測定麥味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚含量［J］.中成藥，2012，34（12）：2 339.

［8］李智慧，吳素香，石森林，等.HPLC法測定不同廠家桂枝茯苓丸中丹皮酚及芍藥苷［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（9）：121.

［9］徐燦輝，何維為，何云飛.HPLC法測定六味地黃膠囊毛蕊花糖苷、馬錢苷和丹皮酚［J］.藥物評價研究，2014，37（3）：257.

［10］杜蓉，張孟佑.HPLC法測定加味逍遙丸中芍藥苷與甘草苷的含量［J］.中國藥房，2015，26（18）：2 571.

（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of Paeoniflorin and Paeonol in Dieda Pill by HPLC

DOU Hongyun，HUANG Dongjie，WANG Mengyang，ZHANG Jie，WANG Xiaoqi，TIAN Yongqing（Cangzhou Institute for Drug and Food Control，Hebei Cangzhou 061001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of paeoniflorin and paeonol in Dirda pill，and provide reference for improving its quality control standard.METHODS：HPLC was performed on the column of ZORBAX C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elutio）at a flow rate of 0.8 ml/min，detection wavelength was 230 nm（paeoniflorin），274 nm（paeonol），columne temperature was 35℃，injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 0.514 8-1.544 5 μg for paeoniflorin（r=0.999 2）and 0.643 2-1.960 4 μg for paeonol（r=0.999 8）；the limits of quantification were 0.135 6，0.126 4 μg，limits of detection were 0.067 8，0.063 2 μg；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 95.78%-97.27%（RSD=0.62%，n=6）and 97.38%-98.38%（RSD=0.42%，n=6）. CONCLUSIONS：The method is simple with good reprosucibility and high sensibility，and can be used for the simultaneous determination of paeoniflorin and paeonol in Dirda pill.

Dieda pill；Paeoniflorin；Paeonol；Content determination；HPLC

R917

A

1001-0408（2016）27-3870-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.42

＊主管藥師。研究方向：藥品檢驗(yàn)。電話：0317-2063949-8202。E-mail：43995455@qq.com

（2015-11-13

2016-07-07）