胰島素樣生長因子結合蛋白6在乳腺癌組織中的表達及意義

趙 楊 薛 晶 張建偉 申興斌

(承德醫學院附屬醫院病理科，河北 承德 067000)

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1 承德醫學院

胰島素樣生長因子結合蛋白6在乳腺癌組織中的表達及意義

趙 楊 薛 晶1張建偉 申興斌

(承德醫學院附屬醫院病理科，河北 承德 067000)

目的 觀察胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)-6在乳腺癌組織中的表達及意義。方法 對60例乳腺癌、60例乳腺纖維腺瘤、60例乳腺增生癥的標本采用免疫組化法檢測IGFBP-6蛋白的表達情況，并用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法檢測乳腺癌、乳腺纖維腺瘤以及乳腺增生癥中IGFBP-6的基因表達情況。結果 乳腺癌組織中IGFBP-6蛋白的表達量明顯低于乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥中蛋白的表達情況(P<0.05)，且乳腺纖維腺瘤中IGFBP-6蛋白的表達量低于乳腺增生癥(P<0.05)；而在IGFBP-6 mRNA表達方面，乳腺癌高于乳腺纖維腺瘤及乳腺增生癥(P<0.01)，乳腺纖維腺瘤高于乳腺增生癥(P<0.01)。結論 IGFBP-6的表達水平可作為乳腺癌患者的預后及淋巴結轉移情況的相關因素，且可作為乳腺癌發生、發展及預后的重要因素。

乳腺癌；胰島素樣生長因子結合蛋白6；免疫組織化學；逆轉錄-聚合酶鏈式反應

胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)-6對胰島素樣生長因子(IGF)-Ⅱ有高度的親和力，并可調節IGF-Ⅱ的活性。IGFBP-6可作為潛在的抗癌靶點，具有正向調節與抗增殖同步效應。體內外研究證實IGFBP-6對某些腫瘤(乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌、橫紋肌肉瘤等)細胞的生長起到抑制作用〔1,2〕。乳腺癌轉移與否是患者死亡的主要原因，所以對患者的評定顯得尤其重要。在國內外對于IGFBP-6與乳腺癌的研究尚未有明確報道，本研究通過免疫組化方法及逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測乳腺癌組織中IGFBP-6的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年4月至2014年2月承德醫學院附屬醫院病理科乳腺癌手術切除石蠟標本60例，年齡26～73(中位49.5)歲，所選乳腺癌均為浸潤性導管癌患者，且病理組織學分型為I級10例，Ⅱ級37例，Ⅲ級13例，有淋巴結轉移者28例，29例患者腫瘤的大小≤2.5 cm，乳腺纖維腺瘤患者60例，年齡16～54歲(中位33歲)；乳腺增生癥患者60例，年齡21～60(中位43)歲。并同時將離體標本在最短時間內剪取50～100 g組織放在-80℃冰箱中以用于RT-PCR。所有標本均經病理主任醫師確診，癌癥患者術前未接受過任何形式的放化療治療。

1.2 免疫組化法檢測各種乳腺組織IGFBP-6蛋白的表達情況 采用免疫組化SP法檢測IGFBP-6蛋白的表達。選取經處理好的蠟塊標本進行連續4 μm厚的切片，并采用防脫片玻片進行常規脫水、脫蠟處理，消除內源性過氧化物酶活性及檸檬酸抗原修復后，用正常血清封閉，依次加入一抗、二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色、蘇木素復染、反藍后觀察結果。根據乳腺癌、乳腺纖維腺瘤、乳腺增生癥三個組的結果分別進行對照分析并判斷結果。

1.3 逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測IGFBP-6 mRNA表達情況 用Trizol一步法提取RNA，用反轉錄酶AMV將RNA反轉錄成cDNA，IGFBP-6基因上游引物：5'CgA ggg gCT CAA ACA CTC TAC3'，下游引物：5'gCC AAC ACC AAC ACT CTT TC3'，擴增產物339 bp；β-actin為內參基因，其上游引物：5'AgC ggg AAA TCg TgC gTg AC3'，下游引物：5'ACA TCT gCT ggA Agg Tgg AC3'，擴增產物:453 bp。取擴增產物4 μl用0.4 g瓊脂糖與20 ml TBS配成凝膠電泳，通過溴乙啶(EB)染色后，在紫外熒光數字成像儀下照相，并進行吸光度定量分析，以每例IGFBP-6與相應β-actin擴增產物條帶累積吸光度(IOD)的比值作為IGFBP-6 mRNA的相對表達量。

1.4 試劑 IGFBP-6購自英國Abcam公司(1∶100稀釋)、DAB顯色劑來自福建邁新生物技術開發有限公司購買，實驗所需無水、乙醇、二甲苯均為分析純均由承德附屬醫院病理科提供，Trizol試劑購自Invitrogen公司，IGFBP-6基因和β-actin均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5 結果分析 通過顯微鏡高倍鏡對5個視野進行觀察，按照陽性細胞數計算：>50%為3分，26%～50%為2分，11%～25%為1分，≤10%計為0分；按照著色的強度：棕黃色為3分，黃色為2分，淡黃色為1分，不著色為0分；兩種類型相加做出陰陽性判斷：6分為()，4～5分為()，2～3分為(+)，<2分為(-)。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件行秩和檢驗、t檢驗和方差分析。

2 結 果

2.1 乳腺組織中IGFBP-6蛋白的表達 在乳腺組織中IGFBP-6表達的陽性部位主要位于細胞質內，表現為棕黃色，見圖1。在三種乳腺組織中,乳腺癌患IGFBP-6的表達低于乳腺增生癥和乳腺纖維腺瘤的表達水平(P<0.01)，且乳腺增生癥與乳腺纖維腺瘤患者的IGFBP-6的表達水平無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 乳腺組織中IGFBP-6蛋白的表達(n=60,n)

與乳腺癌組比較：1)P<0.01

圖1 IGFBP-6在乳腺組織中的表達(DAB，×400)

2.2 IGFBP-6蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關系 乳腺癌標本中IGFBP-6蛋白與患者的年齡和乳腺浸潤性導管的不同組織學分級中的表達無明顯差異(P>0.05)；在腫瘤病灶較大且有淋巴結轉移的乳腺癌中IGFBP-6的蛋白表達顯著低于腫瘤病灶較小及無淋巴結轉移的乳腺癌患者(P<0.05)。見表2。

表2 IGFBP-6蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關系(n)

2.3 各種乳腺組織中IGFBP-6 mRNA的表達 IGFBP-6 mRNA在乳腺癌組的表達(0.39±0.05)高于乳腺纖維腺瘤組(0.60±0.05)及乳腺增生癥組(0.89±0.03,P<0.05,P<0.01),且乳腺纖維腺瘤組中的表達明顯高于乳腺呢增生癥組(P<0.01)。見圖2。

1：1 000 bp DNA Marker；2:乳腺增生癥組；3：乳腺纖維腺瘤組；4:乳腺癌組圖2 IGFBP-6 mRNA在乳腺組織中的表達

2.4 IGFBP-6 mRNA表達與乳腺癌臨床病理指標間的關系 60例乳腺癌標本中IGFBP-6 mRNA與患者的年齡(0≤49歲組0.92±0.05，>49歲組0.92±0.05)和乳腺浸潤性導管的不同組織學分級中的表達(Ⅰ組0.89±0.05，Ⅱ組0.93±0.02，Ⅲ組0.92±0.03)無明顯差異(P>0.05)；在腫瘤病灶較大(0.96±0.03)且有淋巴結轉移(0.91±0.04)的乳腺癌中IGFBP-6 mRNA表達顯著高于腫瘤病灶較小(0.85±0.03)及無淋巴結轉移(0.83±0.04)的乳腺癌患者(P<0.05)。

3 討 論

目前全球乳腺癌發病率的增長速度正以3%的速度遞增，而發病患者正趨于青年化〔3，4〕。乳腺癌的發生發展與體內性激素受體及致癌基因的異常表達有關。胰島素樣生長因子(IGF)作為生長因子在腫瘤的發生發展中的研究正越來越受到重視，IGF信號系統主要是在細胞的增殖、生長、分化、遷移和凋亡等調節方面發揮極為重要的作用〔5～7〕。IGFBP-6主要存在于血清和腦脊液以及身體其他一些細胞中，其表達主要受IGF-Ⅱ及其他激素的調節和控制。據研究表明在人的骨母細胞系中，IGFBP-6在維A酸的作用下表達水平呈增加趨勢〔8〕。對于IGFBP-6的認識在IGFs家族中研究較少，其與胰島素樣結合蛋白家族的每個成員相同，IGFBP-6也屬于一種分泌蛋白，主要是通過與IGF-Ⅱ在血液與組織中結合從而發揮作用。對于IGFBP-6的結構分析可以了解到其C端是由一個高度堿基化的氨基酸序列構成〔9〕。

本研究結果表明IFGBP-6可能有抑制乳腺癌生長的作用；腫瘤細胞不斷增殖的能力是惡性腫瘤生長發展，浸潤和轉移的基本要素和先決條件。由此可知，IGFBP-6在乳腺癌組織中發揮著負向調節及抗增殖作用，根據國內外的研究表明IGFBP-6通過對IGF-Ⅱ的促腫瘤細胞的生長從而抑制不同惡性腫瘤的生長〔10，11〕，其中已在結腸癌、橫紋肌肉瘤、神經母細胞、肺癌、骨肉瘤、鼻咽癌等惡性腫瘤中得到證實，IGFBP-6的表達與腫瘤的惡性程度成負相關〔12～18〕。

較IGFBP-6蛋白的表達相比，IGFBP-6 mRNA的表達情況正好相反，其原因可能是由于在mRNA翻譯過程中其出現問題而使其沒有表達出蛋白的結果，另外其可能與IGFBP-6的非IGF依賴作用有關。現有研究表明：不能結合IGF的突變體和IGFBP-6野生型均可以活化P38MAPK通路，從而誘導結腸癌及橫紋肌肉瘤細胞的轉移〔19〕；IGFBP-6也可抑制造骨細胞的分化，通過與細胞內4(LMP)-1的作用實現〔20〕。

本實驗通過免疫組織化學法和RT-PCR方法檢測出IGFBP-6在乳腺癌中的表達結果不一致。其中從免疫組化結果看發現IGFBP-6蛋白在胞質中表達，而IGFBP-6 mRNA在乳腺癌的表達情況較乳腺其他組織高，考慮IGFBP-6 mRNA在“中心法則”中的翻譯有錯誤，其是否可成為預測乳腺癌轉移和預后一個潛在的腫瘤標志物，有待進一步研究。

1 Oh YS，Kim EJ，Schaffer BS，etal.Synthetic low calcaemic vitamin D(3) analogues inhibit secretion of insulin-like growth factor Ⅱ and stimulate production of insulin-like growth factor-binding protein-6 in conjunction with growth suppression of HT-29 colon cancer cells〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2001；183(1-2)：141-9.

2 Koike H，Ito K，Takezawa Y，etal.Insulin-like growth factor binding protein-6 inhibits prostate cancer cell proliferation：implication for anticancer effect of diethylstilbestrol in hormone refractory prostate cancer〔J〕.Br J Cancer，2005;92(8)：1538-44.

3 劉 力，劉國文，譚米多,等.乳腺癌的綜合治療現狀〔J〕.中國腫瘤外科雜志,2013;5(1):60-3.

4 Lu WL，Li HX，Qian BY，etal.The clinical characteristics and prognosis of Chinese early stage breast cancer patients:a retrospective study〔J〕.Breast J，2010;16(3):331-3.

5 Duan C,Xu Q.Roles of insulin-like growth factor(IGF)binding proteins in regulating IGF actions 〔J〕.Gen Comp Endocrinol,2005;142(1-2):44-52.

6 Clemmons DR.Modifying IGF1 activity：an approach to treat endocrine disorders，atherosclerosis and cancer 〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2007;6(10)：821-33.

7 李 筠，鐘英斌，盧 玲，等.類胰島素生長因子結合蛋白IGFBP-3的研究進展〔J〕.中國海洋大學學報,2011;41(9):41-7.

8 Zhou R，Diehl D，Hoeflich A,etal.IGF-binding protein-4：biochemical characteristics and functional consequences〔J〕.J Endocrinol，2003;178(2)：177-93.

9 Booth BA，Boes M，Andress DL,etal.IGFBP-3 and IGFBP-5 association with endothelial cell：role of C-terminal heparin binding domain〔J〕.Growth Regul,1995;5(1)：1-17.

10 Chaves J,Saif MW.IGF system in cancer:from bench to clinic〔J〕.Anticancer Drugs,2011;22(3):206-12.

11 Kuo YS,Tang YB,Lu TY,etal.IGFBP-6 plays a role as an oncosuppressor gene in NPC pathogenesis through regulating EGR-1 expression〔J〕.J Pathol,2010;222(3):299-309.

12 Gallicchio MA,Kneen M,Hall C,etal.Overexpression of insulin-like growth factor binding protein-6 inhibits rhabdomyosarcom a growth in vivo〔J〕.Int J Cancer,2001;94(3):645-51.

13 Gallicchio MA,Kneen M,Hall C,etal.Urokinase type plasminogen activator receptor is involved in insulin-like growth factor-induced magration of rhabdomyosarcoma cells in vitro〔J〕.J Cell Physiol,2003;197:131-8.

14 陳秋燕,盧 奕,張 健,等.IGFBP-6 與晚期鼻咽癌患者預后的關系以及在鼻咽癌細胞株CNE2增殖中的作用〔J〕.中山大學學報(醫學科學版),2010;4(31):525-9.

15 Leng SL，Leeding KS，Whitehead RH,etal.Insulin-like growth factor(IGF)-binding protein-6 inhibits-IGF-Ⅱ-induced but not basal proliferation and adhesion of LIM 1215 colon cancer cells〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2001；174(1-2)：121-7.

16 Grellier P，De Galle B，Babajko S,etal.Expression of insulin-like growth factor-binding protein 6 complementary DNA alters neuroblastoma cell growth〔J〕.Cancer Res,1998；58(8)：1670-6.

17 Seurin D，Lassarre C，Bienvenu G,etal.Insulin-like growth factor binding protein-6 inhibits neuroblastoma cell proliferation and tumour development〔J〕.Eur J Cancer,2002；38(15)：2058-65.

18 Schmid C，Keller C，Gosteli-Peter M,etal.Mitogenic and antiapoptotic effects of insulin-like growth factor binding protein-6 in the human osteoblastic osteosarcoma cell line Saos-2/B-10〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1999；263(3)：786-9.

19 Fu P，Thompson JA，Bach LA,etal.Promotion of cancer cell migration：an insulin-like growth factor(IGF)-independent action of IGF-binding protein-6〔J〕.J Biol Chem,2007；282(31)：22298-306.

20 Strohbach C，Kleinman S，Linkhart T,etal.Potential involvement of the interaction between insulin-like growth factor binding protein(IGFBP)-6 and LIM mineralization protein(LMP)-1 in regulating osteoblast differentiation〔J〕.J Cell Biochem,2008；104(5)：1890-905.

〔2015-03-21修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)

申興斌(1969-)，男，碩士，碩士生導師，主任醫師，主要從事腫瘤機制方面研究。

趙 楊(1983-)，女，主治醫師，碩士，主要從事腫瘤機制方面研究。

R3

A

1005-9202(2016)19-4812-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.064