針刺對圍絕經期大鼠卵巢顆粒細胞凋亡及Bcl-2、Fas蛋白表達的影響

曹俊紅

(河南省中醫院婦產科，河南 鄭州 450002)

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針刺對圍絕經期大鼠卵巢顆粒細胞凋亡及Bcl-2、Fas蛋白表達的影響

曹俊紅

(河南省中醫院婦產科，河南 鄭州 450002)

目的 探討針刺對圍絕經期大鼠卵巢顆粒細胞凋亡及B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白、介導細胞凋亡蛋白(Fas)表達的影響及針刺治療圍絕經期綜合征的作用機制。方法 從32只SD雌性大鼠中篩選出符合圍絕經期特征的SD雌性大鼠24只，隨機分為針刺組、藥物組、圍絕經期組，各8只，另選擇8只5個月雌性SD大鼠作為青年大鼠組，采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL法)、免疫組化法檢測卵巢顆粒細胞的凋亡及Bcl-2、Fas表達，采用IMS細胞圖像分析法對染色圖像進行分析，對各組陽性染色面積均值進行統計分析，對比各組組間的差異。結果 與青年大鼠組相比，圍絕經期大鼠卵巢顆粒細胞凋亡、Bcl-2蛋白表達、Fas蛋白表達均具有極顯著差異(P<0.01)；針刺治療后大鼠體內卵巢顆粒細胞凋亡減少(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達提高(P<0.05)，Fas蛋白表達降低(P<0.05)，針刺組與藥物組之間大鼠體內卵巢顆粒細胞凋亡、Bcl-2蛋白及Fas蛋白的表達無顯著性差異(P>0.05)。結論 針刺具有抑制圍絕經期大鼠卵巢顆粒細胞凋亡、增加Bcl-2蛋白表達及降低Fas蛋白表達的作用。

針刺；圍絕經期；顆粒細胞；B淋巴細胞瘤-2基因；介導細胞凋亡蛋白

圍絕經期又稱女性更年期，是女性生殖功能由旺盛走向衰退的階段。在此期間，女性身體內卵泡加劇閉鎖、數量減少，導致雌性激素分泌不足，卵巢逐漸停卵并走向功能衰竭〔1〕。現代研究表明，卵泡閉鎖與細胞的凋謝密不可分，其中顆粒細胞的大量凋亡直接誘使卵泡閉鎖急劇化，雌性激素分泌減少，雌二醇水平降低〔2〕。本研究采用針刺療法干預大鼠體內顆粒細胞的凋亡，為針刺治療圍絕經期綜合征的作用機制研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 動物 選取11～14個月SD雌性大鼠32只，體重(380±20)g；5個月SD雌性大鼠8只，體重(300±20)g，均由上海中醫藥大學實驗動物中心提供(質量合格證號：滬醫動證字05號)。

1.2 儀器與試劑 毫針(直徑0.22 mm，長13 mm，購于蘇州華佗醫療器械有限公司)，石蠟切片機(型號HAQ-78J，北京科譽興業科技發展有限公司)，萬能顯微鏡(型號LR66238，OPTON)，攝像機(型號HC-X920MGK-K，Panasonic)，電熱恒溫水溫箱(型號HH.W21.600S，上海躍進醫療器械廠)，電子天平(型號UTP313，上海花潮電器有限公司)；IMS醫用圖像分析系統；更年安片(華潤三九藥業有限公司)，Envision免疫組化試劑，Bcl-2，Fas抗體(美國Santacruz公司)，其他試劑均由實驗室提供。

1.3 方法

1.3.1 圍絕經期大鼠模型的確立 參照文獻〔3〕，對雌性SD大鼠進行陰道組織采樣，并于顯微鏡下觀察HE染色后組織學變化，連續15 d，動情周期呈無規律變化的大鼠確立為圍絕經期大鼠模型。

1.3.2 分組處理 根據陰道組織采樣法，從32只雌性大鼠中篩選出符合圍絕經期特征的雌性大鼠24只，隨機分為針刺組、藥物組、圍絕經期組，每組8只。針刺組：參照《實驗針灸學》相關方法，對大鼠“腎俞”、“足三里”及“三陰交”進行針刺處理，進針深度分別為0.5 cm、0.3 cm、0.3 cm，小幅捻轉后，留針20 min，1次/d，治療15次〔4〕。藥物組：參照人與動物藥用計量換算方法，將更年安片制成濃度為12%的混懸液，對大鼠進行灌胃處理，1次/d，治療15次。5個月雌性SD大鼠作為青年大鼠組，與圍絕經期組均只進行抓取刺激，1次/d，持續15次〔5〕。

1.3.3 樣本采集 治療結束后，斷頭處死所有大鼠，迅速取出右側卵巢，10%甲醛固定后，石蠟包埋切片，備用。

1.3.4 指標檢測方法 采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL法)、免疫組化法卵巢顆粒細胞凋亡和B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)、介導細胞凋亡蛋白(Fas)表達。

1.3.5 評定標準 以切片中卵巢顆粒細胞染色的深淺程度作為判定依據，對各組卵巢顆粒細胞進行比較；以被染色卵巢顆粒細胞染色面積作為指標，采用IMS細胞圖像分析法對其均值進行統計分析。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0軟件計量資料組間比較采用單因素方差分析，方差檢驗齊者用LSD法，方差不齊者用Games-Howell法檢驗，等級資料采用Ridit檢驗。

2 結 果

2.1 卵巢顆粒細胞凋亡的檢測結果 圍絕經期大鼠體內卵巢顆粒細胞顏色普遍較深，多呈棕褐色；針刺組和藥物組次之，多呈棕色或淺棕色；青年大鼠組顏色最淺。在卵巢顆粒細胞凋亡對比中，圍絕經期組與青年大鼠組有極顯著性差異(P<0.01)，圍絕經期與針刺組具有顯著性差異(P<0.05)，藥物組與絕圍經期組、藥物組與針刺組均無顯著差異(P>0.05)。見圖1，表1。

2.2 卵巢顆粒細胞中Bcl-2蛋白表達檢測結果 圖2可見，圍絕經期大鼠體內卵巢顆粒細胞Bcl-2蛋白染色普遍較淺；針刺組與藥物組顏色較深，呈淺棕色、棕黃色；青年大鼠組顏色最深，多呈棕褐色。在卵巢顆粒細胞中Bcl-2蛋白表達對比中，圍絕經期組與青年大鼠組具有極顯著性差異(P<0.01)，圍絕經期與針刺組、藥物組具有顯著性差異(P<0.05)，針刺組與藥物組無顯著性差異(P>0.05)，見表1。表明圍絕經期大鼠體內卵巢顆粒細胞Bcl-2蛋白表達低于青年大鼠組，針刺和藥物可提高卵巢顆粒細胞Bcl-2蛋白的表達，兩者治療效果差別不明顯。見圖2。

圖1 卵巢顆粒細胞(TUNEL染色，×400)

圖2 卵巢顆粒細胞Bcl-2表達(免疫組化染色，×400)

2.3 卵巢顆粒細胞Fas蛋白表達檢測結果 圍絕經期大鼠體內卵巢顆粒細胞Fas蛋白染色較深，針刺組與藥物組顏色次之，多呈先棕色或淺棕色 青年大鼠組最深，呈褐色或棕褐色。圍絕經期組與青年大鼠組、針刺組、藥物組均具有極顯著性差異(P<0.01)，針刺組與藥物組無顯著性差異(P>0.05)，見表1，圖3。

表1 各組卵巢顆粒細胞凋亡及Bcl-2、Fas蛋白表達結果

與圍絕經期組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖3 卵巢顆粒細胞Fas表達(免疫組化染色，×400)

3 討 論

圍絕經期是女性絕經前一段時間，多伴隨著月經紊亂、抑郁、煩躁、失眠、潮熱、盜汗、骨質疏松等癥狀，隨著現代社會生活壓力增大，圍絕經期綜合征已經成為影響患者的身心健康和家庭和睦的一個主要因素，成為醫學界亟待解決的重大疾患之一〔6〕。中醫根據對圍絕經期綜合征的辨證論治，認為腎虛該病之本〔7〕；臨床實踐發現中藥及體針治療對更年期綜合征均具有較好的治療效果，其中針刺療效高，副作用小，易于操作，易于患者接受，具有廣闊的發展前景〔8〕。

近年來，有學者分別從器官、基因等方面對圍絕經期綜合征進行了實驗研究〔9〕，發現絕經前，女性卵巢內顆粒細胞不斷的增殖與分化，為卵泡細胞的發育、成熟提供有利環境，成熟卵泡的數量維持在生殖需要的正常范圍內，卵巢功能正常運行。進入圍絕經期，卵巢內顆粒細胞不斷凋亡，導致卵泡發生強烈閉鎖，無法回到正常發育軌道，數量也急劇減少，患者體內雌激素、孕激素水平降低，卵巢功能緩慢走向衰竭。因此，卵巢顆粒細胞的凋亡與卵巢的衰退具有密不可分的聯系。而卵巢顆粒細胞的凋亡是由多基因共同參與調控的結果，如Bcl-2蛋白、Fas蛋白、P53等，其中Bcl-2具有抑制凋亡作用，顆粒細胞中Bcl-2蛋白的表達與卵泡的閉鎖相關。本文結果發現圍絕經期大鼠卵巢內顆粒細胞凋亡和Fas蛋白表達均明顯高于青年大鼠組，Bcl-2蛋白表達顯著低于青年大鼠，針刺和藥物治療都具有抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，提高卵巢顆粒細胞Bcl-2蛋白的表達，抑制Fas蛋白的表達的作用，提高體內雌性激素水平，其中針刺治療組效果要略優于藥物治療組，但結果不具有顯著性差異。根據實驗結果分析，針刺治療圍絕經期綜合征可能是通過抑制卵巢顆粒細胞凋亡，調節Bcl-2基因、Fas基因的表達，減緩卵泡的閉鎖性衰退過程，增加了體內卵泡發育成熟的幾率，使得患者體內雌性激素水平提高而發揮治療效果。

1 Jarzgzabek-Bielecka G，Wilczak M，Potasińska-Sobkowska A，etal.Overweight，obesity and female sexuality in perimenopause：a preliminary report〔J〕.Prz Menopauzalny，2015；14(2)：97-104.

2 Frye JB，Lukefahr AL，Wright LE，etal.Modeling perimenopause in Sprague-Dawley rats by chemical manipulation of the transition to ovarian failure〔J〕.Comp Med，2012；62(3)：193-202.

3 Shengqiang L，Wenna L，Yachan L，etal.Effect of Chaihushugan San on expression of the Raf/mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase pathway in the hippocampi of perimenopausal rats induced by immobilization stress〔J〕.J Tradit Chin Med，2015；35(4)：445-52.

4 余光曙.實驗針灸學〔M〕.北京：人民衛生出版社，2012：75-82.

5 張大方，金若敏.藥理與中藥藥理實驗〔M〕.上海：上海科學技術出社，2008：6.

6 郝 晶，李淑杏，陳長香，等.社區女性圍絕經期綜合征的危險因素〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(9)：2534-5.

7 冒湘琳，張麗娟，陸黎黎，等.卵巢早衰的中醫辨證論治〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2014；20(21)：240-2.

8 金春蘭，木村通郎，平尾幸久，等.針刺對超排卵小鼠卵巢反應及卵巢組織FSH-R表達的影響〔J〕.北京中醫藥，2012；31(8)：620-3.

9 Zhang K，Zeitlian G，Adel G，etal.Enhanced hypothalamic-pituitary sensitivity to estrogen in premenopausal women with diminished ovarian reserve compared with older perimenopausal controls〔J〕.Menopause，2011；18(8)：880-5.

〔2015-11-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

曹俊紅(1973-)，女，碩士，主治醫師，主要從事中西醫婦產科方面的研究。

R71

A

1005-9202(2016)19-4714-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.019