小鼠腦缺氧后SA1在神經細胞中的表達變化

盧 佳 高艷斌 馬 可 陳志明 王治軍

(吉林大學中日聯誼醫院眼科，吉林 長春 130033)

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小鼠腦缺氧后SA1在神經細胞中的表達變化

盧 佳 高艷斌1馬 可2陳志明3王治軍4

(吉林大學中日聯誼醫院眼科，吉林 長春 130033)

目的 檢測小鼠腦缺氧后SA1在神經細胞中的轉錄表達變化。方法 將60只小鼠共分為10組，采用手術方式結扎右側頸總動脈，分別于術后3、6、9、12 h、1、3、5、7 d處死。逆轉錄PCR擴增SA1 cDNA，應用RT-PCR檢測其轉錄表達變化。結果 實驗組6 h后SA1表達增高，其表達量隨時間延長增高(P<0.05)。結論 SA1在小鼠腦缺氧后表達增高，說明腦缺氧后細胞染色體黏附發生改變。

腦缺氧；SA1

在細胞分裂過程中，染色體完整復制后均勻分配到子代細胞中對于遺傳的穩定性至關重要，不正確的染色體分離與腫瘤的發生、發育異常及老化密切相關〔1,2〕。黏附復合物在染色體分離過程中發揮關鍵作用〔3〕。盡管染色體間黏附在細胞復制過程中建立，但黏附復合物在G1期即通過SA1和SA2蛋白裝配到染色體上，故SA1蛋白在細胞染色體的正確分離調控過程中發揮無法替代的作用〔4,5〕。但關于SA1蛋白在腦缺氧后的表達變化卻未見報道。本研究擬探討SA1表達與小鼠腦缺氧后不同時間段的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立 雄性ICR小鼠100只，隨機分為正常對照及腦缺氧組。腦缺氧組分別于術后3、6、9、12 h、1、3、5、7 d(n=6)處死，共計8組，每組6只。處死后取腦組織并迅速置于液氮中速凍，2 min后取出保存于-80℃冰箱中。采用手術結扎右側頸總動脈，用 10%水合氯醛深度麻醉，剪去頸部皮毛，消毒皮膚后沿中線切開皮膚，暴露右側頸總動脈后，結扎后縫合皮膚，置鼠籠(37℃，給氧氣)喂養。正常對照組僅切開頸部皮膚，不做任何處理。

1.2 RNA提取 按照100 mg/ml Trizol試劑將裂解腦組織在室溫孵育10 min；加0.2 ml氯仿后混勻，室溫孵育10 min后，12 000 r/min(4℃)離心10 min。吸取上層水相置于另一EP管中，加等量異丙醇，室溫孵育10～20 min,12 000 r/min(4℃)離心10 min。加1 ml 75%乙醇進行洗滌，12 000 r/min(4℃)離心5 min，棄上清；沉淀室溫下自然干燥；用DEPC水溶解RNA沉淀。采用RT-PCR試劑盒進行逆轉錄PCR。

1.3 RT-PCR檢測 取0.2 ml薄壁PCR管，分組編號。向各管中加入2×qPCR TaqMix 12.5 μl，10 μmol/L各基因正反向引物混合物1 μl。引物序列GAPDH正義TGTGGGCATCAATGGATTTGG，反義ACACCATGTATTCCGGGTCAAT，片段長度116 bp，溫度61℃,SA1正義TGGCAGCGAGCTTGAAGAAA，反義CCACCTCAAATAATGTGACAGGC，片段長度206 bp，溫度62℃。管中不加模板用作陰性對照。各管補加水至25 μl。混勻置于熒光定量PCR儀中。

1.4 統計學分析 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

在實驗組中，SA1在顱腦缺氧后表達持續增高；而對照組腦組織中SA1表達量穩定；SA1在小鼠腦缺氧6 h后表達增高，缺氧1 d后達峰值。見表1。

表1 SA1在小鼠缺氧后轉錄表達變化

3 討 論

染色體的正確分離與基因遺傳穩定性密切相關，不正確的染色體分離會導致非整倍體細胞的產生，從而引起發育異常、凋亡發生甚至腫瘤的產生。SA1蛋白對于細胞分裂過程中染色體的正確分離有重要作用，源于其在有絲分裂G1期可介導黏附復合物裝配于染色體上。黏附復合物由SMC3、SMC1、SCC1及SCC3構成，目前認為上述復合物可形成環狀拓撲結構，從而將姐妹染色體包繞于其中，盡管SA1及SA2將黏附復合物裝配于染色體的具體機制仍然不清，但SA1在染色體分離調控過程中的重要作用已被眾多學者所證實〔6,7〕。基因組測序結果證實，SA1基因突變可直接導致發育性疾病的產生。但其與腦缺氧的關系卻未見有報道，本研究證實，在急性腦缺氧神經細胞中，SA1的表達量隨時間改變而發生改變，提示腦缺氧后神經細胞的染色體分離會受到很大影響，而對腦缺氧后染色體分離調控的研究可能對腦組織修復具有重要意義。

1 Higgins JM.Chromosome segregation:learning to let go〔J〕.Curr Biol,2013;23:R883-5.

2 Murayama Y,Uhlmann F.Chromosome segregation:how to open cohesin without cutting the ring〔J〕?EMBO J,2013;32：614-6.

3 Leman AR,Noguchi E.Linking chromosome duplication and segregation via sister chromatid cohesion〔J〕.Methods Mol Biol,2014;1170:75-98.

4 Tarnowski LJ,Kowalec P,Milewski M,etal.Nuclear import and export signals of human cohesins SA1/STAG1 and SA2/STAG2 expressed in Saccharomyces cerevisiae〔J〕.PloS One,2012;7:e38740.

5 Krasikova A,Barbero JL,Gaginskaya E.Cohesion proteins are present in centromere protein bodies associated with avian lampbrush chromosomes〔J〕.Chrom Res,2005;13:675-85.

6 Liu J,Krantz ID.Cohesin and human disease〔J〕.Ann Rev Genom Human Genet,2008;9：303-20.

7 Musio A,Selicorni A,Focarelli ML,etal.X-linked cornelia de lange syndrome owing to SMC1L1 mutations〔J〕.Nature Genet,2006;38:528-30.

〔2016-05-26修回〕

(編輯 曲 莉)

吉林省科技廳國際科技合作項目(20160414048GH)

1 長春市公安司法鑒定中心 2 吉林大學第一醫院兒科急診

3 吉林大學基礎醫學院法醫系 4 吉林大學第一醫院小兒外科

王治軍(1979-)，男，主治醫師，主要從事小兒外科疾病的診治研究。

盧 佳(1979-)，女，主治醫師，主要從事眼科常見病及眼科病理學研究。

R36

A

1005-9202(2016)19-4711-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.017